1 背景知識(shí)介紹

進(jìn)行 PCR 反應(yīng)時(shí)需要寡核苷酸引物 (rs)。 我們需要設(shè)計(jì)與 DNA/cDNA 模板區(qū)域互補(bǔ)的引物。 當(dāng)一次添加一個(gè)核苷酸時(shí)，核苷酸上的反應(yīng)基團(tuán) ( ) 必須選擇性地封閉 ( ) 和解除封閉 ( )。 引物的主要特點(diǎn)是它們必須與模板分子上的序列相對(duì)應(yīng)（必須與模板鏈互補(bǔ)（ ））。

當(dāng)然，引物不需要與模板鏈完全對(duì)應(yīng)（例如添加酶切位點(diǎn)或構(gòu)建突變位點(diǎn)的引物）； 但引物的3'端必須與模板DNA鏈完全對(duì)應(yīng)（所以當(dāng)我們添加酶切位點(diǎn)時(shí)，它是5'端），這樣才能延伸。 通常3'端使用鳥嘌呤（，G）或胞嘧啶（，C），盡量不要有腺嘌呤（，A），引物的5'端通常有幾個(gè)核苷酸延伸（）。 另外，雜交引物（ ）的3'端必須相互指向，因此我們?cè)诤铣梢飼r(shí)，總是從5'端開(kāi)始向3'端開(kāi)始。

引物的長(zhǎng)度對(duì)于擴(kuò)增特定序列很重要。 短引物主要用于擴(kuò)增小而簡(jiǎn)單的DNA片段。 另一方面，長(zhǎng)引物用于擴(kuò)增真核基因組 DNA 樣本。 但是，引物不應(yīng)太長(zhǎng)（>30bp 引物）或太短（<15bp）。 當(dāng)然，當(dāng)我們的模板很純的時(shí)候，引物就不受這些規(guī)則的限制，可以根據(jù)實(shí)際情況定義引物的長(zhǎng)度。 短引物更不準(zhǔn)確。 也就是說(shuō)，非特異性DNA擴(kuò)增產(chǎn)物增多，表現(xiàn)為電泳時(shí)出現(xiàn)很多非特異性條帶。 長(zhǎng)引物的缺點(diǎn)是它們導(dǎo)致雜交速率較慢。 平均而言，待擴(kuò)增的 DNA 片段大小應(yīng)在 1-10kb 范圍內(nèi)。 實(shí)踐告訴我們，我們比較放大的長(zhǎng)度是3Kb及以下，當(dāng)然這也取決于物種。

（圖1引物擴(kuò)增示意圖。PCR基因擴(kuò)增方向與體內(nèi)合成方向一致，即從5'端到3'端。）

引物設(shè)計(jì)還應(yīng)注意以下規(guī)則：引物的結(jié)構(gòu)應(yīng)相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免內(nèi)部折疊； 我們還需要避免引物-引物退火，這會(huì)產(chǎn)生引物二聚體并破壞擴(kuò)增過(guò)程； 設(shè)計(jì)時(shí)如果不確定引物的某個(gè)位置放置什么核苷酸，可以在該位置包含多個(gè)核苷酸，這稱為混合位點(diǎn)； 您還可以使用基于核苷酸的分子插入物（肌苷）來(lái)取代傳統(tǒng)的核苷酸，以獲得更廣泛的配對(duì)能力。

考慮到上述信息，底漆通常應(yīng)具有以下特性：

(1)長(zhǎng)度為18-24個(gè)堿基；

(2)G/C含量40-60%；

(3)以1-2對(duì)G/C開(kāi)始和結(jié)束；

(4)退火溫度(Tm)50-60℃；

(5) 引物對(duì)之間的Tm差異應(yīng)在5℃以內(nèi)；

(6)引物對(duì)不應(yīng)有互補(bǔ)區(qū)域；

（當(dāng)然這是在比較理想的狀態(tài)下，如果狀態(tài)不理想，可以嘗試以此作為參考）

2 NCBI引物設(shè)計(jì)實(shí)踐

2.1 定量引物規(guī)則

最重要的是特異性（即只擴(kuò)增需要檢測(cè)的基因）。 其他規(guī)則（1）引物長(zhǎng)度為20-21 bp； (2)避免引物中連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)或更多相同堿基，如AAAAA或GGGGG； (3)每個(gè)引物兩端的堿基最好是G或C(GC堿基之間有3個(gè)氫鍵，以保證引物與模板連接的穩(wěn)定性)； (4)GC含量為45%~55%； (5) PCR產(chǎn)物大小為85~300 bp； (6)引物應(yīng)盡可能跨越內(nèi)含子和外顯子； (7) 參考上節(jié)引物設(shè)計(jì)規(guī)則； （八）其他。

2.2 NCBI設(shè)計(jì)定量引物

2.2.1 以NCBI查mRNA序列（以人TNF-α）為例

(1)尋找人類TNF-α基因。 方法如圖2-1所示。 點(diǎn)擊

（圖2-1 NCBI檢索人TNF-α基因）

(2) NCBI定位需要引物設(shè)計(jì)的基因并左鍵點(diǎn)擊。

（圖2-2 選擇我們需要研究的TNF-α）

(3)TNF-α相關(guān)信息()

因?yàn)槲覀冎皇窃O(shè)計(jì)引物，所以不需要閱讀太多的信息。 但值得注意的是，有些基因有很多剪接體，因此選擇合適的剪接體非常重要。 如果我們知道具體研究哪個(gè)拼接體，直接選擇即可； 如果我們不知道要研究哪個(gè)剪切體，只需選擇最長(zhǎng)或研究最多的剪切體即可。

（圖2-3 TNF-α剪接體信息，共包含1條信息，用于qPCR引物設(shè)計(jì)）

（4）點(diǎn)擊：.4進(jìn)入mRNA詳細(xì)信息頁(yè)面（）

A。 查看信息，包括每個(gè)外顯子、內(nèi)含子和 CDS 區(qū)域

（圖2-4查看外顯子、內(nèi)含子和CDS區(qū)域信息，因?yàn)樵O(shè)計(jì)是為了跨越外顯子-內(nèi)含子）

b. 第一個(gè)外顯子在1-363之間，CDS區(qū)域在178-897之間。 讓我們學(xué)習(xí)一下定量引物設(shè)計(jì)的規(guī)則。 一般定量引物會(huì)選擇mRNA的前500bp或者第一個(gè)外顯子或者CDS，所以這里我們選擇TNF-α的前600bp（當(dāng)然具體長(zhǎng)度可以適當(dāng)改變）用于定量引物設(shè)計(jì)（序列可以復(fù)制或另存為文件）。

(5) NCBI引物設(shè)計(jì)

這里我們使用NCBI的BLAST功能選項(xiàng)進(jìn)行設(shè)計(jì)

(a) 打開(kāi)NCBI網(wǎng)站()dnastar引物設(shè)計(jì)，找到BLAST選擇框，如下圖紅框所示；

(b)找到“-BLAST”選擇框并左鍵單擊

(c) 新頁(yè)面優(yōu)先：輸入基本序列，或從文件中拖動(dòng)序列； 然后限制上下游引物的起始位置（記住qPCR產(chǎn)物在85-300bp之間的約定，其他規(guī)則軟件會(huì)自動(dòng)設(shè)置（固定的，不用擔(dān)心），這里我們選擇1-150的位置設(shè)置為上游（ ）-200-500 下游（ ）；產(chǎn)品長(zhǎng)度設(shè)置為85-300，如下圖所示。

(d) 點(diǎn)擊本頁(yè)底部的“獲取”；

(e) 檢查并提交序列所屬基因信息，勾選復(fù)選框并點(diǎn)擊“”；

(f)等待界面，軟件設(shè)計(jì)引物需要時(shí)間，幾分鐘甚至更長(zhǎng)時(shí)間，等待即可……；

(g) 獲取引物信息。 這里需要檢查引物的特異性，檢查引物下面是否還有其他mRNA信息。 如果不包含，說(shuō)明該引物特異性極高，只能擴(kuò)增我們需要的mRNA（TNF-α）。

(h) 保存所需的qRT-PCR引物（當(dāng)引物較多時(shí)，以最上面的引物為主，為了使實(shí)驗(yàn)盡可能成功，建議合成兩對(duì)或更多對(duì)定量引物）

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7定量引物設(shè)計(jì)實(shí)踐

俗話說(shuō)，有太多的技能需要克服。 這個(gè)概念對(duì)于設(shè)計(jì)引物也是一樣的。 在極少數(shù)情況下，NCBI 設(shè)計(jì)的引物可能無(wú)法用于實(shí)驗(yàn)。 例如，熔解曲線不是標(biāo)準(zhǔn)峰（非單峰），不能靶向基因。 靶向效率低等。 因此，為了實(shí)驗(yàn)的成功，掌握另一種設(shè)計(jì)定量引物的方法是極其有必要的。 對(duì)了，文末附上了oligo 7的下載位置，不然你就說(shuō)我流氓了！

3.1 寡核苷酸引物設(shè)計(jì)規(guī)則

具體規(guī)則如上所述。 只要回頭看看。 如果你還不知道如何露手或露屁股dnastar引物設(shè)計(jì)，我就打你三巴掌，讓你再做一次。

3.2 使用oligo 7設(shè)計(jì)定量引物

(a) 打開(kāi)oligo 7軟件

(b) 點(diǎn)擊：file-new，然后將序列粘貼進(jìn)去，點(diǎn)擊紅框中的“√”；

(c) 點(diǎn)擊“- for & probs...”，然后選擇“probs & ”/當(dāng)然，你也可以選擇“PCR”，但是會(huì)很多，所以點(diǎn)擊“”即可；

(d) 獲取引物信息

e) 保存定量引物，一定要選擇要保存的引物，“文件-保存-”，選擇位置（如果找不到，別怪我沒(méi)說(shuō)清楚）并給它命名；

上游底漆：

下游引物：

(f) 合成引物（導(dǎo)出的引物都是5'端到3'端，直接發(fā)送合成即可）：

:交流電

:CTC

（對(duì)了，導(dǎo)出的引物序列需要軟件打開(kāi)，最后也發(fā)到這里（），下載地址：；提取碼：1179）

（寫在最后，歡迎轉(zhuǎn)載引用傳播科學(xué)價(jià)值！??！關(guān)注博主，有用的話點(diǎn)贊+討論是博主繼續(xù)更新的動(dòng)力?。。。?/p>

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