提示：

1、基因測(cè)序可以診斷和消除污染；

2.測(cè)序和序列比對(duì)可用于確定菌株類型和親緣關(guān)系；

3.生活，。

在之前的病原測(cè)定技術(shù)推文中介紹過，PCR檢測(cè)是確定病原體的神器。 但PCR陰性條帶可能是非特異性擴(kuò)增，需要測(cè)序驗(yàn)證； 可診斷基因測(cè)序，排除污染； 但更重要的是，測(cè)序和序列比對(duì)可用于確定菌株種類和相關(guān)性。 我們先不談目前流行的NGS（next, deep ）診斷方法，只介紹常規(guī)PCR后的直接測(cè)序或克隆測(cè)序。

測(cè)序方法主要使用物理切割法（MAxam-）——基本不用了

以及在 DNA 鏈末端終止合成（方法）。 它是基于雙脫氧內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核苷酸（ddA、ddT、ddC和ddG）加入DNA鏈后會(huì)停止延伸的特點(diǎn)。 根據(jù)從固定點(diǎn)開始的堿基，隨機(jī)在一個(gè)特定的核苷酸上懸浮，但在每個(gè)核苷酸旁邊都有熒光標(biāo)記，形成一系列以A、T、C、G結(jié)尾的四組粗細(xì)不同的堿基，然后通過尿素變性 PAGE 凝膠電泳測(cè)量。 因此，一種獲得可見 DNA 核苷酸序列的方法。

該方法經(jīng)過優(yōu)化后，使用熒光代替放射性同位素標(biāo)記是人工DNA序列分析的基礎(chǔ)。 手動(dòng)DNA測(cè)序儀可以用不同的熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧堿基，然后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，用四種激光在不同大小的DNA片段上打出熒光分子。 使其發(fā)出四種不同波長的熒光，測(cè)量裝置采集熒光信號(hào)，據(jù)此確定DNA核苷酸的序列。

說了這么多，雖然今天實(shí)驗(yàn)室的男小雞基本都是打電話叫測(cè)序公司的小哥來冷凍室拿樣本（一般是PCR產(chǎn)物），公司會(huì)負(fù)責(zé)跑膠鑒定回收排序。 最快第二天，序列將通過電子郵件發(fā)送。

測(cè)序結(jié)果返回后如何分析病毒的親緣關(guān)系，我的朋友dnastar序列比對(duì)，我們實(shí)驗(yàn)室檢查組組長張新輝寫了詳細(xì)的操作，并做了一些修改，分享如下：

序列分析軟件種類繁多，常用的有軟件和軟件包。 用于查看測(cè)序峰，判斷測(cè)序質(zhì)量，截取有效序列片段； 分為測(cè)量結(jié)果序列比較過程中常用的、、、、等多個(gè)軟件。

下面以in-line場(chǎng)景描述序列分析比對(duì)的過程：

一般樣本送到測(cè)序公司幾天后，就會(huì)收到測(cè)序結(jié)果，如圖：

下載短信中的附件

解壓后你會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)檢查用的會(huì)有兩種格式的文件

AB1后綴的文件是測(cè)序結(jié)果的電泳圖，可以用軟件打開，通過電泳圖可以知道測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確區(qū)域

通常，方法1和方法2結(jié)合使用。 一般情況下，測(cè)序結(jié)果的頭尾峰非常雜亂，序列不準(zhǔn)確。 在序列比對(duì)過程中，我們通常需要將測(cè)序結(jié)果的首尾序列片段切掉，然后再進(jìn)行分析。 在進(jìn)行PCR測(cè)序時(shí)，需要流出足夠多的側(cè)翼序列，使PCR片段設(shè)計(jì)得比實(shí)際需要測(cè)序的片段大，從而保證能夠得到足夠完整的基因序列。 如果將PCR產(chǎn)物克隆到載體中，可以根據(jù)載體上的通用質(zhì)粒序列來保證后面不準(zhǔn)確的區(qū)域都是載體序列。 插入序列時(shí)，已經(jīng)是整齊的峰圖，不會(huì)影響測(cè)序結(jié)果。

我們一般用打開SEQ文件，可以看到測(cè)序結(jié)果并進(jìn)行進(jìn)一步的編輯操作。

我們根據(jù)電泳圖結(jié)果刪除SEQ文件中第一個(gè)和最后一個(gè)不穩(wěn)定片段，并保存編輯后的文件（截去開頭和結(jié)尾，根據(jù)電泳圖的均勻性選擇截?cái)嘈蛄校?/p>

使用名稱保存文件。

將其保存在容易找到的位置。

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理后dnastar序列比對(duì)，使用軟件與具有代表性的外源菌株進(jìn)行核苷酸相似性比較。

將代表病毒株和測(cè)序結(jié)果的SEQ文件拖入軟件中，上下拖拽調(diào)整序列順序。

選擇“Align”>“ByW”（W比較時(shí)間更長更準(zhǔn)確）； 如果想看多肽序列的同源性，可以先把核酸序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后比較，前提是核酸序列是正確的 3個(gè)核苷酸的3個(gè)核苷酸排列成3個(gè)核苷酸，以密碼子的第一位，否則會(huì)引起移碼，導(dǎo)致翻譯困難或提前終止。

軟件開始逐條手動(dòng)比較，序列的長度、數(shù)量和筆記本配置將決定需要多長時(shí)間才能完成。

比對(duì)完成后，選擇“查看”>“”顯示序列間的同源性。

對(duì)比結(jié)果如下，以PRRSV的ORF5測(cè)序?yàn)槔?/p>

比對(duì)之后，做一個(gè)表統(tǒng)計(jì)相關(guān)度。

通過PRRSV測(cè)序結(jié)果與參考菌株序列對(duì)比，可以大致看出菌株的來源。 通常，PRRSV測(cè)序選擇的參考毒株應(yīng)包括北美原型毒株VR-2332、國外經(jīng)典毒株CH1-a、HP-PRRSV毒株JXA1（HuN4也可以）、HP-PRRSV衍生的-R (P80)、（或類似）菌株和新流行的 QYYZ 和 GM2。 對(duì)于亞洲型LV，如果它與歐洲型菌株的關(guān)系很低，則進(jìn)行比較。

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