最近，由于之前的測(cè)序公司又窮又馬虎，本著“忍不住，常變，常新”的原則，決定換家試試。

在適應(yīng)新公司的送樣方式和測(cè)序結(jié)果等方面，學(xué)到了一些東西，這也是我明天要分享的兩點(diǎn)：

1. 最常用的核苷酸測(cè)量技術(shù)：雙脫氧終止法 2. 最實(shí)用的技巧：測(cè)序結(jié)果的序列拼接

首先，讓我談?wù)勥@種雙脫氧懸浮法是如何引起我的注意的。

在看新公司測(cè)序軟件的使用說明書時(shí)，聽到這句話（藍(lán)色的句子）：

想起有一次和老師或師兄們討論實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常被批評(píng)：

為什么您的測(cè)序結(jié)果中缺少您的質(zhì)粒序列？

這就要從雙脫氧懸浮法的原理說起了……

具體來說，emm 等人。 1977年提出這種測(cè)序方法，其原理是：當(dāng)核苷酸模板在核苷酸聚合酶、引物和四種單脫氧核苷酸存在下進(jìn)行復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果進(jìn)入四管反應(yīng)體系，四種雙脫氧核苷酸分別被按比例介紹。 只要雙脫氧核苷酸并入鏈末端，鏈就停止伸長(zhǎng)，而在鏈末端摻入單個(gè)脫氧核苷酸的片段可以繼續(xù)伸長(zhǎng)。 這樣，在每個(gè)管式反應(yīng)系統(tǒng)中，以共同引物為5'端，雙脫氧核苷酸為3'端，合成一系列不同寬度的核苷酸片段。 反應(yīng)終止后，進(jìn)行四泳道電泳。 通過將不同長(zhǎng)度的核苷酸片段分開（相鄰片段之間的寬度僅相差一個(gè)核苷酸），根據(jù)片段3'端的雙脫氧核苷酸，可以依次讀取合成片段的核苷酸序列。

這有點(diǎn)復(fù)雜。 大致意思是在系統(tǒng)中加入dNTP和ddNTP混合物。 遇到dNTP不要緊，遇到ddNTP就停下來。 有興趣的同學(xué)可以看下面兩張圖。

圖1

圖 2

（圖片來自：）

了解原理后可以知道，我們產(chǎn)品在測(cè)序過程中，在模板的引導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTPs加到質(zhì)粒的3'-OH端，使質(zhì)粒延伸，合成一條新的互補(bǔ)DNA鏈.

所以！上次有人責(zé)怪你，你可以告訴他

-stop測(cè)序從質(zhì)粒3'端后的第一個(gè)核苷酸開始，沒有質(zhì)粒的序列~

之后再討論一下，收到公司發(fā)給你的測(cè)序結(jié)果，但是沒有拼接的那個(gè)怎么辦？

首先第一步其實(shí)就是問你為什么不給我拼接，以后會(huì)不會(huì)拼接。 雖然時(shí)間就是金錢，各位小伙伴們，該偷懶的時(shí)候可以偷懶哦~

第一時(shí)間與銷售溝通

其次，還要懂得自己做，豐衣足食，不求人，不求己。 先來學(xué)習(xí)下序列拼接吧~

-- 簡(jiǎn)單版 () --

下載一個(gè)，上一篇好像有下載地址，想不起來了，還是百度下吧。

腳步

導(dǎo)入是，是或不是，你點(diǎn)一下就知道了。 得到你想要的序列后，去文件——“”選擇格式保存。

——進(jìn)階版（之）——

是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的序列分析軟件。 軟件由七個(gè)模塊組成，明天講七分之一，剩下的六個(gè)模塊我都不懂hhh

主要用于多序列的拼接，可拼接數(shù)萬個(gè)序列（最多可達(dá)64000多個(gè)序列）。 同時(shí)，在拼接前，可以對(duì)人工測(cè)序的序列結(jié)果中質(zhì)量較差的序列進(jìn)行剪裁，剔除污染序列或攜帶序列。 ，提供內(nèi)置的編輯和導(dǎo)出功能。

1. 簡(jiǎn)單的拼接，與前述類似

這里要注意一點(diǎn)：如果導(dǎo)出seq文件，只能看到序列結(jié)果； 如果導(dǎo)出ab1文件，可以聽到序列+峰圖（推薦）

大家可以根據(jù)自己的需要選擇

這里我選擇了seq，但是我選錯(cuò)了，重新選擇了之前的ab1文件

然后點(diǎn)擊左上角，得到拼接好的：

序列可根據(jù)電泳圖自動(dòng)校正

最后一步是導(dǎo)入序列。

2.自動(dòng)恢復(fù)被手動(dòng)修正的序列結(jié)尾

根據(jù)跡線數(shù)據(jù)和矢量序列的質(zhì)量，可以在組裝前手動(dòng)修剪末端

修剪其實(shí)很好，當(dāng)我們想看到原始的完整序列時(shí)：

找到小黑棒并拖放

底色為白色的部分為系統(tǒng)微調(diào)部分

3.向量序列的消除

在序列比對(duì)過程中，測(cè)序結(jié)果中富含某些載體序列dnastar拼接序列，有時(shí)會(huì)給我們?cè)斐苫煜?，因此我們可以在拼接前剔除載體序列，對(duì)結(jié)果進(jìn)行一定程度的優(yōu)化。

在 中，默認(rèn)有一些向量序列：

查看系統(tǒng)中的向量序列

如果沒有您使用的運(yùn)營(yíng)商dnastar拼接序列，請(qǐng)自行添加

添加新運(yùn)營(yíng)商時(shí)的注意事項(xiàng)

最后可以導(dǎo)入并與未清除的向量序列進(jìn)行比較

OK，大致就是這樣，雖然有時(shí)候公司有幾千上百個(gè)訂單，你打電話叫人給你拼接，浪費(fèi)的時(shí)間和生氣得不償失。

學(xué)會(huì)了這個(gè)簡(jiǎn)單的方法，媽媽再也不用害怕我的序列拼接了。 祝大家100%序列匹配，wink~

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