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RT-PCR質粒設計應遵循的主要原則是：

(1) 設計質粒并在核苷酸保守區(qū)保持特異性；

(2) 質粒的厚度通常為15-30bp，GC濃度通常為40%-60%；

(3)質粒模板序列的Tm值應保持在72℃左右；

(4) 質粒3'端的核苷酸符合四個“不”：

一“不”：不使用A，二“不”：不出現(xiàn)連續(xù)3個以上的核苷酸（如GGG和CCC），三“不”：不互補、二聚體或頭飾結構，四“不”：不能停在密碼子的第3位；

(5) 核苷酸隨機分布，質粒本身與質粒之間嚴禁出現(xiàn)四個連續(xù)的核苷酸互補； 6. 引物3'端的ΔG值低，5'端和引物中部的ΔG值高，呈余弦曲線狀。

PCR質粒設計常用的軟件有《Oligo》、《》、《》等，操作比較復雜，對于科研初學者來說比較困難。

明天給大家介紹一種適合菜鳥的質粒設計方法，特別適合剛入門的菜鳥。

網站 1：

網站 2：

打開網站，單擊“全部”下拉選項，然后選擇“基因”。

在方框內輸入目標基因（以Akt為例），如圖搜索Aktdnastar引物設計，可以看到顯示了很多Akt基因，選擇對應的物種，比如rat（家鼠），rat（大鼠） , human（人類）等，這里需要選擇大鼠（）物種的Akt。

打開Akt1，下拉網址，在NCBI()中選擇(s)，點擊.1，復制Akt1的基因序列。

如何進行質粒設計？

打開（生工官網），點技術服務，點 Free ，將上面復制的基因序列復制進去，按提示要求檢查（以大鼠Akt基因為例，如下），提交質粒設計清單。

如何查看質粒設計結果？

點擊質粒設計列表，查看結果可以看到Akt基因設計的質粒。 在合成質粒之前，我們需要對設計好的質粒進行BLAST驗證。 通過軟件模擬，我們可以看到它是否可以放大我們的目標基因。 .

如何對質粒進行BLAST驗證？

打開網站，下拉，點擊-BLAST，復制上面設計的質粒，將選項改為 (taxid:10090)（根據(jù)品系選擇dnastar引物設計，本例為大鼠品系），最后點擊Get for BLAST驗證（結果需要等待幾秒），觀察結果，如果驗證得到的基因是Akt，即設計的質粒符合要求，可以用于PCR實驗。

以上就是借助兩個網站進行質粒設計的步驟，是不是很簡單？ 希望對剛入實驗室的男士有所幫助！

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