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熒光探針方法使用序列特異性熒光標記探針來測量產(chǎn)物。 探針方法的出現(xiàn)促使定量PCR技術的特異性較常規(guī)PCR技術大大增強。 目前比較常提到的有探針、FRET雜交探針（熒光共振能量轉移探針）和分子信標。

探針法長期以來已被廣泛應用，但有人認為這些技術依賴于Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 通常試劑廠家只校準Taq酶的聚合酶活性，不會同時校準Taq酶的5`-3`核酸外切酶活性。 `對于核酸外切酶活性的校準，不同批次試劑之間的定量會存在差異。 另外，探針的熔解溫度（Tm）僅要求低于60℃，這使得不同試劑盒之間的特異性參差不齊，難以進行質量控制檢查。

1. 實時熒光探針設計

總體原則：探針和質粒的選擇應保守，因此必須找到100-200 bp的相對保守片段來設計質粒和探針。 即real-的擴增片段為50bp----150bp。 當找不到150bp的保守片段時，必須確保探針的片段是保守的。

設計探針和質粒時，請考慮在兩條鏈上設計質粒和探針。 但需要注意的是，在該鏈上設計探針時，應接近同一條鏈上設計的質粒（即上游質粒）。 這樣就可以保證在以后的擴增中，即使擴增不完全，也會有熒光信號的報告。 兩者之間的距離優(yōu)選為從探針5'端到上游質粒3'的1個核苷酸，但也可以重疊。

如果在原始序列中找不到合適的探針和質粒（1主要是探針與上游質粒的距離太遠，但與下游質粒的距離比較短；2要求突變位點在探針的5'端也可以測量熒光信號，但在3'端），質粒和探針可以設計成互補序列。

另外，實時PCR中探針和質粒的Tm值低于正常PCR中質粒和雜交探針的Tm值。

2. 探頭設計

探頭設計的基本原則：

1.保守性：探針必須絕對保守，有時分型僅由探針決定。 理論上，如果存在核苷酸錯配，可能不會被檢查到。 如果找不到完全保守的片段，則只能選擇具有一處核苷酸差異的片段。 并且這種不同的核苷酸優(yōu)選位于探針的中間，對探針與目標片段的雜交影響較小。 兩端最好不要有不同的核苷酸，因為兩端不利于探針的雜交。 并且優(yōu)選A或T，但不是G或A，因為A、T是官能團，并且G、A是三鍵。

2、探針寬度：探針的厚度最好在25-32bp之間，Tm值在68-72℃之間，最好70℃，以保證探針的Tm值高于質粒10°C，以確保探針在發(fā)射時先于質粒與目標片段結合。 因此，探針最好含有GC保守片段，以保證較高的Tm值。 如今，有 MGB 探測器。 TAMER后標記MGB可以使探針的Tm值更高。 雖然探針片段較短，但也能滿足探針的Tm值要求（68-70℃）。

3.探針名稱：應標明探針在基因組中的位置和粗細。

4.探針Tm值估計：Tm值可以用oligo或軟件估計。 確保探針中的 GC 濃度為 30-80%。 應防止探針中出現(xiàn)多個重復的核苷酸，特別是應防止四個或更多的G核苷酸。

5.探頭評估：使用軟件中的軟件，點擊“日志”菜單中的“”，在“名稱”中輸入探頭的名稱和位置，按Tab鍵輸入“”，將數(shù)據(jù)粘貼或輸入到待分析的探針序列。 選擇整個序列后，在“”菜單下，分析探針的二聚體。 彈出窗口告訴探針有多少個二聚體，并用dG值評估探針（一般給出最差的dG值，dG值越大理論上越好）。 在“”菜單“”下，解剖探頭的頭帶結構。 彈出窗口會告訴您有多少個探針，并對這些探針進行評估。 在多重熒光PCR中，需要對多個探針進行“配對二聚體”分析。

6. 探針的5'端不能是G，因為雖然單個G核苷酸與FAM熒光報告基團羧基連接，但G可以猝滅FAM羧基發(fā)出的熒光信號，從而引起假陽性。

7、探針與質粒之間的位置：探針應靠近上游質粒，即探針應靠近同一條鏈上的上游質粒。 兩者之間的距離優(yōu)選為從探針5'端到上游質粒3'端的1個核苷酸，但也可以重疊。 需要保證探針5'端距離上游質粒5'端至少4bp。

喜歡：

探測

5' → 3' 5' FAM → 3' 染料

后序：

5'--3'

補充已發(fā)表序列

3'--5'

3'←5'

或者：

5'→3'

后序：

5'--3'

補充已發(fā)表序列

3'--5'

材質染色3'←MAF5'3'←5'

探測

探測

3. 質粒設計

1. 上下游質粒應保存

為了擴增出所需的保守片段，必須對保守的100-200個片段進行PCR擴增。 因此，質粒的選擇也應該非常保守。 最好不要有不同的核苷酸。 如有必要，質粒 3' 端至少 4 個核苷酸必須完全保守。

在設計保守型質粒時，需要在已發(fā)表序列上找到保守且一致的區(qū)域，即在已發(fā)表序列的5'端，質粒的3'端至少有5個bp是保守的，并且在已發(fā)表序列的 3' 端 質粒位置在 5' 端尋找至少 5 bp 的保守性。

5'3'

后序：

5'--3'

3'5'

2. 上下游質粒的厚度和Tm值

上下游質粒的厚度通常在18-25bp之間，Tm值在58-60℃之間。 確保質粒中的 GC 濃度為 30-80%。 應防止質粒中出現(xiàn)多個重復的核苷酸，特別是應防止4個或更多的G核苷酸。 質粒的3'端優(yōu)選不是G或/和C。質粒3'端的5個核苷酸中不應有2個G或/和C。

上游質粒應標記為F()，且位于基因組的位置和厚度； 下游質粒應標記為R（），并且應位于基因組的位置和厚度。 Tm值可以用oligo或軟件來估計。 上下游質粒Tm值差異不應超過2℃，寬度差異不應超過4bp。

3. 質粒的評估

使用軟件中的軟件，點擊“l(fā)og”菜單中的“”，在“name”中輸入質粒的名稱和位置，按Tab鍵輸入“”，粘貼或輸入待分析的質粒序列。 選擇整個序列后，在“”菜單下，分析質粒的二聚體。 彈出窗口告訴該質粒有多少個二聚體，并用dG值來評估該質粒（一般給出最差的dG值，理論上dG值越大越好）。 在“”菜單“”下，解剖質粒的頭飾結構。 彈出窗口顯示有多少個質粒，并評估質粒。 然后選擇需要的上下游質粒，并在“pair”菜單下分析上下游質粒。 彈出窗口告訴質粒有多少個二聚體，并用dG值來評估質粒（一般給出最差的dG值，理論上dG值越大越好（dG值一般為負值） ，絕對值超過4.5kcal/mol容易造成質粒二聚體條帶的形成，增加質粒的有效含量，使PCR反應無法正常進行）。 無需考慮質粒與探針之間的配對和頭套結構，因為探針的Tm值非常高。

4、上下游質粒與探針的距離（上下游質粒的位置）

理論上，上游質粒的3'端距離探針5'端1-20 bp，最好是1 bp，最近上游質粒的3'端距離3'端4 bp探頭的； 針之間有一定的距離，但需要保證下游質粒的3'端距離探針3'端至多15-150bp。 整個目標片段的厚度優(yōu)選在50-150bp之間，最長不超過200bp。

5. 簡并質粒的設計

為了能夠同時擴增，雖然質粒位點有突變目標片段，但如果多個核苷酸出現(xiàn)的概率相同，就需要設計一個代表該位點多個核苷酸的簡并體。 合成質粒時，在合成該位點時，不是添加1個核苷酸，而是同時添加以簡并體為代表的多個核苷酸。 這樣，實質上合成的質粒除了簡并位置的核苷酸不同之外，是多個質粒。 但對于簡并質粒，應考慮每個質粒的Tm值，保證簡并subs代表的不同核苷酸的Tm值差異不超過2℃。 如果超過2℃，在保證質粒3'端相同的情況下，在Tm值較低的核苷酸質粒5'端添加幾個核苷酸dnastar引物設計，使Tm值相同。 但此時并不是簡并質粒，而是兩個粗細不同、簡并子位點核苷酸不同、但Tm值相同的兩個質粒分別合成，最后等含量混合。

5'→3'

順序：

'-/NNNNN-3'

RR

4. 實時多重 PCR 探針的選擇

1、多重實時PCR有兩個意義：一是選擇保守的探針和質粒，并使用不同的色素標記探針，在檢驗時根據(jù)熒光的顏色來判斷不同的產(chǎn)品。 另一種是選擇保守的質粒，擴增不同厚度的目標片段，在反應中添加SYBRN色素，最后根據(jù)不同目標片段的Tm值判斷不同的項目。

2.多重實時PCR的熒光探針應為同一類型：同時作為探針，或同時作為MGB探針，或同時作為探針。

3. MGB探頭的優(yōu)點

A。 MGB探針較短（14-20bp），更容易找到所有測序序列的較短片段的保守區(qū)域。

b. 短片段探針（14-20bp）添加MGB后，Tm值會提高10℃，更容易滿足熒光探針Tm值的要求。

4 MGB探頭的設計原理

1) 探針的 5' 端阻止 G 出現(xiàn)。 盡管探針被酯化成單個核苷酸，但與報告官能團連接的G核苷酸仍然可以猝滅該官能團的熒光信號。

2）用軟件評估Tm值，Tm值應為65-67℃。

3) MGB探針盡可能短，但探針厚度不超過13bp。

4）盡量避免重復的核苷酸，特別是G核苷酸，防止出現(xiàn)4個或更多的G重復。

5）原則上，只要MGB探針中存在核苷酸突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針不會與目標片段雜交，不會形成熒光信號）。 因此，在進行SNP檢查時，為了測量突變體，即MGB不與目標片段雜交，不形成熒光信號，而探針的目標片段形成熒光信號測量，探頭盡量放置在中間1/3的地方。 注：為了滿足上述要求的四個條件，探針的突變位點可以連接到3'端，但突變位點在3'端前面至少2個核苷酸（即必須確保探針核苷酸的最后兩個核苷酸絕對保守）以進行SNP檢查。 反之，如果要進行類似的檢查，則應找到保守的片段區(qū)域，并且探針中不應有突變位點。 如果探針只有13 bp，則探針仍然不完全保守。 突變有好幾個，突變位點也應該靠近探針的5'端，這樣即使是突變，探針也能與目標片段雜交，形成熒光信號。 另一種方法是設計簡并探針，即使是突變也能實現(xiàn)突變的檢測。

5、多重PCR中dnastar引物設計，多重PCR中質粒之間的相互干擾和探針之間的相互干擾分析

設計完每對質粒和探針后，重新使用軟件中的軟件打開保存在同一文件中的多重PCR的質粒文件，然后選擇設計的多重質粒或成對選擇設計的多重質粒。 探針后，在“pair”菜單下，分析上游和下游質粒。 彈出窗口告訴我們該質粒有多少個二聚體，并用dG值來評估該質粒（一般會給出最差的dG值，理論上dG值越大越好）。

6. 多個實時熒光PCR擴增片段的影響

最好每個多重擴增的目標片段具有相同的寬度，但寬度不應相差太大。

7.同一亞型明顯分為幾組，想要同時擴增整個亞型的質粒和探針設計策略。

先設計每個亞群的保守質粒和探針，然后將探針用相同的色素標記，這樣在實時PCR反應中，雖然是多重PCR反應，但報告的卻是同一個色素報告基因。

熒光標記探針測得的產(chǎn)物特異性較強。 該探針是熒光定量PCR中常用的熒光探針。 通常探針5′端熒光標記的復合物有FAM、VIC等。探針3′端熒光標記基團為TAMRA等。

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