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一般定量PCR實(shí)驗(yàn)流程為：目的基因搜索與比對(duì)→探針和引物設(shè)計(jì)→探針和引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實(shí)驗(yàn)并優(yōu)化條件→獲得曲線數(shù)據(jù)并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較→重復(fù)確認(rèn) 。

第一步：在目標(biāo)基因搜索和比對(duì)過(guò)程的第一步dnastar引物設(shè)計(jì)，可以使用NCBI序列等軟件完成目標(biāo)DNA或RNA的搜索和比對(duì)——相信很多人在分析測(cè)序報(bào)告時(shí)都這樣做過(guò)，而這一步需要注意的重要一點(diǎn)是要確保所分析的序列在內(nèi)（即染色體某些區(qū)域中相鄰DNA片段的重疊）。

第二步：如果其他條件一致，那么這第二步——引物和探針的設(shè)計(jì)可以說(shuō)是定量PCR成敗的關(guān)鍵。 通過(guò)總結(jié)各方面經(jīng)驗(yàn)，有以下基本原則：

一般原則：

* 先選擇探針，然后設(shè)計(jì)引物，使其盡可能靠近探針。

* 所選序列應(yīng)具有高度特異性，并盡量選擇二級(jí)結(jié)構(gòu)最少的擴(kuò)增片段——這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，也會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。 建議先進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè)。 如果二次組織無(wú)法避免，則應(yīng)相應(yīng)提高退火溫度。

* 擴(kuò)增長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)400bp，最好在100-150bp內(nèi)。 擴(kuò)增片段越短，越容易獲得有效的擴(kuò)增反應(yīng)。 較短的擴(kuò)增片段也更容易確保分析的一致性。

* 保持GC含量在20%到80%之間。 GC豐富的區(qū)域容易發(fā)生非特異性反應(yīng)，這會(huì)導(dǎo)致熒光染料分析中的擴(kuò)增效率降低和非特異性信號(hào)。

* 為保證效率和重現(xiàn)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）

* 引物和探針相互配對(duì)，以避免形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

底漆設(shè)計(jì)原則：

* 序列選擇應(yīng)在基因的保守片段中

* 避免引物本身或與引物之間形成4個(gè)或更多連續(xù)對(duì)，避免引物本身形成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)

*典型引物長(zhǎng)度為 18 至 24 個(gè)核苷酸。 引物需要足夠長(zhǎng)，以確保序列的唯一性并減少序列出現(xiàn)在非目標(biāo)序列位點(diǎn)的可能性。 但引物長(zhǎng)度超過(guò) 24 個(gè)核苷酸并不意味著特異性更高。 較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)配的序列雜交，從而降低特異性，并且比較短的序列雜交得更慢，從而降低產(chǎn)量。

* Tm值為55-65℃（因?yàn)楹怂嵬馇忻富钚栽?0℃時(shí)最高），GC含量為40%-60%

* 避免引物間TM差異超過(guò)2℃

* 避免在引物3'端使用堿基A，并避免在引物3'端有3個(gè)或更多連續(xù)的相同堿基。

* 為了避免擴(kuò)增，最好設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)外顯子的引物。

* 探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在 50bp 至 150bp 之間

* 引物末端（最后 5 個(gè)核苷酸）不能有超過(guò) 2 個(gè) G 和 C。

探頭設(shè)計(jì)原則：

* 將探針盡可能靠近上游引物

* 探針長(zhǎng)度應(yīng)為15-45bp（最好20-30bp）以確保結(jié)合特異性

* 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)

* Tm值為65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少5℃），GC含量為40%-70%

* 避免在探針5'端使用G鳥(niǎo)嘌呤——因?yàn)?'G會(huì)有猝滅作用，即使被切割仍然會(huì)有猝滅作用。

* 整個(gè)探針中，堿基C的含量明顯高于G的含量——高G含量會(huì)降低反應(yīng)效率。 在這種情況下，應(yīng)選擇另一條配對(duì)鏈作為探針。

* 為保證引物探針的特異性，最好對(duì)設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行blast驗(yàn)證。 如果存在非特異性互補(bǔ)區(qū)域，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。

MGB探頭設(shè)計(jì)：

* 避免探針 5' 端出現(xiàn) G。 即使探針被水解成單個(gè)堿基，與報(bào)告基團(tuán)連接的G堿基仍然可以猝滅該基團(tuán)的熒光信號(hào)。

*Tm值應(yīng)為65-67℃。

* 盡量縮短MGB探針，但探針長(zhǎng)度不應(yīng)小于13bp。

* 盡量避免重復(fù)堿基，尤其是G堿基。 應(yīng)避免 4 個(gè)或更多 G 重復(fù)。

* 原則上，只要MGB探針中有1個(gè)堿基突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針不會(huì)與目標(biāo)片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)）。 因此，在進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)，為了檢測(cè)突變體，即MGB不與目標(biāo)片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號(hào)，探針目標(biāo)片段產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，探針的突變位點(diǎn)應(yīng)盡量放置在探頭的中間1/3處。 地方。

注：為了滿足以上四個(gè)要求，可以將探針的突變位點(diǎn)移至3'端，但突變位點(diǎn)至少位于3'端前面2個(gè)堿基（即最后兩個(gè)堿基）進(jìn)行SNP檢測(cè)時(shí)必須保證探針的堿基絕對(duì)保守。 另一方面，如果你想進(jìn)行類似的檢測(cè)，你應(yīng)該尋找保守的片段區(qū)域，并且探針中不應(yīng)該有突變位點(diǎn)。

如果探針只有13 bp，則探針仍然不是完全保守的。 有多個(gè)突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)該靠近探針的5'端。 這樣，即使存在突變，探針仍然可以與目標(biāo)片段雜交并產(chǎn)生熒光信號(hào)。 另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，即使發(fā)生突變也能檢測(cè)到突變。

第三步：找一家值得信賴的公司來(lái)合成引物和探針。 一般引物合成大家都很熟悉，價(jià)格也比較便宜（尤其是近兩年），而探針則相對(duì)貴一些。 一般來(lái)說(shuō)，引物合成要便宜得多。 探針合成價(jià)格從1000元到5000元不等（不同的合成要求有所不同）——而這還只是標(biāo)記的價(jià)格。 序列合成與引物合成基本相似。

步驟4、5、6：一般的定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)其實(shí)和普通PCR沒(méi)有太大區(qū)別。 只需要添加探針即可。 另一個(gè)區(qū)別是分步方法。 需要注意的是：

* 擴(kuò)增酶最好使用熱啟動(dòng)酶

* 引物和探針的濃度需要優(yōu)化。 有人建議從50nM開(kāi)始，在50nM-900nM之間優(yōu)化，通常是200nM（注意探針需要避光保存）

*同樣，鎂和酶量也需要優(yōu)化。 酶的推薦反應(yīng)濃度為1.25-1.5U（50ul）

A模板的添加量通常小于100ng。 由于不同類型的DNA模板含有不同的目的基因拷貝數(shù)，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋以確定最佳的DNA模板添加量。 如果要進(jìn)行2-Step RT-PCR反應(yīng)的第二次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步中用作DNA模板的RT反應(yīng)液的量不應(yīng)超過(guò)PCR反應(yīng)液總體積的10% 。

此外，雖然循環(huán)參數(shù)是在引物和探針設(shè)計(jì)后確定的，但有時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

步驟7：進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，通常使用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程。 方程的斜率可用于檢查 PCR 的效率。 對(duì)于 100% PCR 效率，理想的斜率為 3.32。

最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于PCR擴(kuò)增效率為90%-100%（100%是指每次循環(huán)后，模板總數(shù)將增加到前一次的2倍）。 所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析都需要較高的相關(guān)系數(shù)（R2≥0.99），這樣實(shí)驗(yàn)過(guò)程和數(shù)據(jù)才能認(rèn)為可信。

使用這個(gè)方程我們可以計(jì)算未知樣本的初始模板量。 大多數(shù)定量 PCR 機(jī)器都配有軟件，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算未知樣品的初始模板量。

有兩種基本方法：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。 研究人員需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇。 絕對(duì)定量是指通過(guò)將未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)對(duì)其進(jìn)行分析。 一般來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)品是已知絕對(duì)濃度的DNA樣本。 需要注意的是，絕對(duì)定量分析的準(zhǔn)確度是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度而言的。

相對(duì)定量是指兩個(gè)或多個(gè)基因相互比較，結(jié)果是一個(gè)比率； 沒(méi)有測(cè)量到確切的數(shù)字。

另外，由于不同樣品的反應(yīng)過(guò)程存在一定的差異，除了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量外，還需要設(shè)計(jì)表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果。 β-肌動(dòng)蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（-3-、GAPDH）是兩種常用的看家基因，此外還有18sr RNA、β-、β-等。

應(yīng)該指出的是，這些基因可能受到反應(yīng)條件的影響。 在設(shè)計(jì)定量表達(dá)研究時(shí)，保證初始對(duì)照基因的質(zhì)量是必要的步驟，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯咳藛T會(huì)通過(guò)對(duì)一系列內(nèi)參基因定量結(jié)果取幾何平均值來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行量化。 數(shù)據(jù)是標(biāo)準(zhǔn)化的。

另一個(gè)問(wèn)題是如何判斷所獲得數(shù)據(jù)的質(zhì)量。 關(guān)于放大曲線，經(jīng)驗(yàn)總結(jié)是：

1、總體來(lái)看，曲線拐點(diǎn)清晰，指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行度優(yōu)良，基線平坦無(wú)上升，低濃度樣品擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯的。

2. 曲線指數(shù)期的斜率反映了擴(kuò)增效率。 斜率越大，擴(kuò)增效率越高。 擴(kuò)增效率越高，試劑靈敏度性能越好。

3. 基線。 圖上的基線為陰性樣本的擴(kuò)增曲線。 平坦或略微下降的曲線是良好試劑的標(biāo)志。 消極和積極的價(jià)值觀很明顯，很難誤判。 如果有上升趨勢(shì)，可能會(huì)造成陰性樣本的誤診。

4、曲線之間的平行性非常好dnastar引物設(shè)計(jì)，說(shuō)明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。 外標(biāo)定量是基于各管擴(kuò)增效率相同的假設(shè)，因此擴(kuò)增效率越相似，定量的重復(fù)性和準(zhǔn)確性越好。 更好。 擴(kuò)增效率是否相似，通過(guò)擴(kuò)增曲線圖中曲線的平行度來(lái)體現(xiàn)。

5、低濃度曲線指數(shù)期明顯。 一方面較少發(fā)生假陰性和陽(yáng)性誤判，另一方面表現(xiàn)出較高的敏感性。

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