最近因?yàn)橹暗臏y(cè)序公司既不好又馬虎，秉著“忍不了就常換”的原則，我決定換一家公司試試。

在適應(yīng)新公司的樣本交付方式、測(cè)序結(jié)果等過程中，我學(xué)到了一些東西，這就是我今天要分享的兩點(diǎn)：

1、最常用的核酸檢測(cè)技術(shù)：雙脫氧終止法 2、最實(shí)用的技巧：測(cè)序結(jié)果的序列拼接

首先我們來說說這種雙脫氧終止方法是如何引起我的注意的？

當(dāng)我在看一家新公司的測(cè)序軟件使用說明時(shí)，看到這樣一句話（紅色的那句話）：

讓我想起有一次我和老師或者學(xué)長討論實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常被問到：

為什么您的引物序列不包含在測(cè)序結(jié)果中？

這就要從雙脫氧終止法的原理說起……

具體來說，emm 等人。 1977年提出了這種測(cè)序方法，其原理是：當(dāng)核酸模板在核酸聚合酶、引物和四個(gè)單脫氧堿基存在的情況下進(jìn)行復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果是在四管反應(yīng)系統(tǒng)中，則有四個(gè)雙脫氧堿基按比例引入。 只要鏈端摻入雙脫氧堿基，鏈就會(huì)停止延伸，而鏈端摻入單個(gè)脫氧堿基的片段可以繼續(xù)延伸。 這樣，在反應(yīng)系統(tǒng)的每個(gè)試管中合成了一系列不同長度的核酸片段，其中公共引物為5'端，雙脫氧堿基為3'端。 反應(yīng)終止后，進(jìn)行四泳道電泳。 為了分離不同長度的核酸片段（相鄰片段的長度僅相差一個(gè)堿基），可以根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基依次讀取合成片段的堿基序列。

這有點(diǎn)復(fù)雜。 這可能意味著將 dNTP 和 ddNTP 的混合物添加到系統(tǒng)中。 遇到dNTP沒關(guān)系，但是遇到ddNTP就停止。 有興趣的朋友可以看下面兩張圖。

圖1

圖2

（圖片來自：）

了解了大致原理后，您可以知道，我們產(chǎn)品的測(cè)序過程中，聚合酶在模板的引導(dǎo)下，不斷地將dNTP添加到引物的3'-OH端，使引物延伸，合成新的互補(bǔ)DNA股。

所以！下次有人問你的時(shí)候，你可以直接告訴他

雙脫氧終止法測(cè)序從引物 3' 末端后的第一個(gè)堿基開始。 沒有測(cè)序引物序列~

那么，我們?cè)儆懻撘幌?strong>dnastar拼接序列，當(dāng)你拿到公司發(fā)給你的測(cè)序結(jié)果，沒有拼接的時(shí)候，你該怎么辦？

首先第一步當(dāng)然是問我為什么沒有被拼接，以后會(huì)不會(huì)再被拼接。 畢竟時(shí)間就是金錢，朋友們，該偷懶的時(shí)候就可以偷懶啦~

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其次，我們還要懂得自己動(dòng)手，才能豐衣足食。 尋求幫助比自求更好。 我們先來學(xué)習(xí)一下如何進(jìn)行序列拼接吧~

——簡(jiǎn)易版()——

下載一個(gè)。 上一篇好像有下載地址。 我記不清了，或者你可以從百度下載。

腳步

導(dǎo)出只需點(diǎn)擊它即可查看是或否。 獲得所需的序列后，文件 -> 另存為 -> 選擇保存格式。

——進(jìn)階版（之）——

它是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的序列分析軟件。 該軟件由七個(gè)模塊組成。 今天我要講的就是其中的七分之一。 剩下的6個(gè)沒看懂哈哈

主要用于多個(gè)序列的拼接。 它可以組裝數(shù)千個(gè)序列（最多支持 64,000 個(gè)序列）。 同時(shí)，在拼接前dnastar拼接序列，可以對(duì)質(zhì)量較差的序列進(jìn)行修剪，去除自動(dòng)測(cè)序的序列結(jié)果中的污染序列或載體序列。 ，提供完整的編輯和輸出功能。

1.簡(jiǎn)單拼接，與上面提到的類似

這里需要注意的一點(diǎn)是：如果導(dǎo)入seq文件，只能看到序列結(jié)果； 如果導(dǎo)入ab1文件，可以看到序列+峰值圖（推薦）

根據(jù)自己的需求選擇即可

這里我選擇了seq，但是我選錯(cuò)了，然后我重新選擇了ab1文件。

然后點(diǎn)擊左上角，就會(huì)得到拼接結(jié)果：

您可以根據(jù)峰值圖手動(dòng)校正序列。

最后一步是導(dǎo)出序列。

2.手動(dòng)恢復(fù)自動(dòng)更正的序列結(jié)束

根據(jù)跡線數(shù)據(jù)質(zhì)量和矢量序列，在組裝前自動(dòng)進(jìn)行端部修整

修剪當(dāng)然很好，但是當(dāng)我們想看到整個(gè)原始序列時(shí)：

找到小黑棒并拖動(dòng)它

黃色底色部分為系統(tǒng)修剪部分

3.去除向量序列

在序列比對(duì)過程中，含有某些載體序列的測(cè)序結(jié)果有時(shí)會(huì)給我們帶來麻煩，因此我們可以在拼接前去除載體序列，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行一定程度的優(yōu)化。

其中，默認(rèn)有一些向量序列：

檢查系統(tǒng)中的向量序列

如果您使用的向量不可用，請(qǐng)自行添加

添加新運(yùn)營商時(shí)的注意事項(xiàng)

最后，可以將其導(dǎo)出并與序列進(jìn)行比較，而無需刪除向量。

好吧，大致就是這樣。 畢竟，有時(shí)公司有數(shù)百個(gè)訂單。 如果你打電話請(qǐng)人幫你把它們放在一起，那就不值得花時(shí)間和憤怒。

學(xué)會(huì)了這些簡(jiǎn)單的方法后，媽媽再也不用擔(dān)心我的序列拼接了。 祝大家的序列100%匹配，眨眼~

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