提示：

1、基因測序可明確診斷，消除污染；

2、測序和序列比對可確定病毒株的類型和親緣關(guān)系；

3.生活，生活就是ATCG。

在之前關(guān)于病原體檢測技術(shù)的推文中，我們介紹了PCR檢測是確定病原體的有力工具。 但PCR中的陽性條帶可能是非特異性擴增dnastar序列比對，需要測序驗證； 基因測序可以確診并消除污染； 但更重要的是，測序和序列比較可用于確定菌株種類和關(guān)系。 先不說目前流行的NGS（next，深度測序）方法進行診斷。 我們只會介紹常規(guī)PCR后的直接測序或克隆測序。

測序方法主要采用化學(xué)裂解法（MAxam-）——基本不再使用。

以及DNA鏈末端合成終止方法(方法)。 它利用了雙脫氧核糖核酸（ddA、ddT、ddC 和 ddG）在添加到 DNA 鏈后終止延伸的特性。 基于核苷酸起始于固定點并隨機終止于特定堿基的事實，并在每個堿基后面進行熒光標(biāo)記，生成一系列以A、T、C、G結(jié)尾的四組不同長度的核苷酸，然后在尿素變性的 PAGE 凝膠上進行電泳檢測以獲得可見的 DNA 堿基。 一種堿基序列的方法。

對該方法進行優(yōu)化后，使用熒光代替放射性核素標(biāo)記是自動化DNA序列分析的基礎(chǔ)。 自動DNA測序儀可以用不同的熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進行測序反應(yīng)。 反應(yīng)產(chǎn)物通過電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，用四束激光激發(fā)不同大小的DNA片段上的熒光分子。 它發(fā)出四種不同波長的熒光，檢測器收集熒光信號并據(jù)此確定DNA堿基的序列。

說了這么多，其實現(xiàn)在實驗室里的少男少女們基本上都是打電話讓測序公司的小伙子來冰箱里取樣本（一般是PCR產(chǎn)物）。 該公司將負(fù)責(zé)測序的凝膠鑒定和回收。 第二天，該序列就會發(fā)送到電子郵件中。

關(guān)于測序結(jié)果返回后如何分析病毒的親緣關(guān)系，我們實驗室檢測組組長張新輝寫了詳細(xì)的操作，并做了一些編輯和修改，分享如下：

可用的序列分析軟件有多種類型，常用的是軟件和軟件包。 用于查看測序峰、判斷測序質(zhì)量、截取有效序列片段； 分為 、 、 、 等多個軟件，常用在檢測結(jié)果的序列比對過程中。

下面用一個carry-in的場景來描述序列分析和比對的過程：

通常，將樣本發(fā)送給測序公司幾天后，您就會收到如下所示的測序結(jié)果：

下載電子郵件中的附件

解壓后，您會發(fā)現(xiàn)送檢的樣本有兩種格式的文件。

AB1后綴的文件是測序結(jié)果的峰圖，可以用軟件打開。 通過峰圖可以知道測序結(jié)果的準(zhǔn)確性以及準(zhǔn)確的面積。

一般情況下，方法1和方法2結(jié)合使用。 通常情況下，測序結(jié)果的頭峰和尾峰比較雜亂，序列不準(zhǔn)確。 在序列比對過程中，我們一般要先將測序結(jié)果的頭尾序列片段剪掉再進行分析。 做PCR測序時，需要流出足夠的側(cè)翼序列，使得PCR片段設(shè)計得比實際需要測序的片段大，這樣才能保證獲得足夠完整的基因序列。 如果將PCR產(chǎn)物克隆到載體中，利用載體上的通用引物進行測序，就可以保證之前不準(zhǔn)確的區(qū)域都是載體序列，而且插入序列時峰型會很整齊，不會出現(xiàn)重復(fù)的情況。影響測序結(jié)果。

我們通常會打開SEQ文件，以便看到測序結(jié)果并進行進一步的編輯操作。

我們根據(jù)峰值圖的結(jié)果刪除SEQ文件中首尾不穩(wěn)定的片段，并保存編輯后的文件（截斷頭部和尾部，根據(jù)峰值圖的整潔程度選擇截斷的序列）

用名稱保存文件。

保存到您可以輕松找到的位置。

測序結(jié)果處理后，利用軟件與國內(nèi)現(xiàn)有的代表性菌株進行核酸相似度比對。

將代表菌株和測序結(jié)果的SEQ文件拖入軟件中，上下拖動可調(diào)整序列順序。

選擇“對齊”>“按W”（W比較時間更長，更準(zhǔn)確）； 如果你想看氨基酸序列的同源性，可以先將核苷酸序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后進行比較，前提是核苷酸序列按3個堿基排列正確，并從第一個開始位，否則會發(fā)生移碼，導(dǎo)致翻譯失敗或過早終止。

軟件開始自動進行一一比較。 序列的長度、數(shù)量和計算機配置將決定完成它需要多長時間。

比對完成后，選擇“查看”>“”即可顯示序列之間的同源性。

以PRRSV的ORF5測序為例，對比結(jié)果如下。

比較后，制作一個表格來統(tǒng)計相似度。

通過PRRSV測序結(jié)果與參考毒株序列的對比，可以大致看出毒株的來源。 一般情況下，PRRSV測序時選擇的參考株應(yīng)包括北美原型株VR-2332、國內(nèi)經(jīng)典株CH1-a、HP-PRRSV株JXA1（HuN4和HuN4均可）、HP-PRRSV衍生株等。 MLV JXA1-R（P80）（或類似）菌株以及新流行的QYYZ和GM2。 如果歐洲毒株LV與美國毒株的親和力很低，則進行比較。

--謝謝大家dnastar序列比對，獎勵和召喚是前進的動力--

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