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RT-PCR引物設(shè)計(jì)需要遵循的主要原則是：

(1)引物應(yīng)設(shè)計(jì)在核酸保守區(qū)域內(nèi)并保持特異性；

(2)引物長度一般為15-30bp，GC含量一般為40%-60%；

(3)引物模板序列的Tm值應(yīng)維持在72℃左右；

(4)引物3'端的堿基滿足四個(gè)“不”：

一“否”：無A，二“否”：不超過3個(gè)連續(xù)堿基（如GGG和CCC），三“否”：無互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，四“否”：無在密碼子位置終止3；

(5)堿基隨機(jī)分布dnastar引物設(shè)計(jì)，且引物本身與引物之間連續(xù)四個(gè)堿基不互補(bǔ)； 6、引物3'端ΔG值較低，5'端和中間ΔG值較高，呈正弦曲線形狀。

PCR引物設(shè)計(jì)常用的軟件有“Oligo”、“”、“”等，操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于科研新手來說較難上手。

今天給大家介紹一種適合新手的引物設(shè)計(jì)方法，非常適合剛入門的新手。

網(wǎng)站1：

網(wǎng)站2：

打開網(wǎng)站，單擊“全部”下拉選項(xiàng)，然后選擇“基因”。

在框中輸入目標(biāo)基因（以Akt為例），如圖搜索Akt，可以看到顯示了很多Akt基因，選擇對(duì)應(yīng)的物種，如mouse（家鼠）、rat（大鼠） ）、人類（人類）等。這里需要選擇小鼠（家鼠）品種的Akt。

打開Akt1，下拉網(wǎng)站，在NCBI()中選擇mRNA和(s)，點(diǎn)擊.1，復(fù)制Akt1的基因序列。

如何設(shè)計(jì)引物？

打開（生工官網(wǎng)），點(diǎn)擊技術(shù)服務(wù)dnastar引物設(shè)計(jì)，點(diǎn)擊 Free ，將之前復(fù)制的基因序列復(fù)制進(jìn)去，根據(jù)提示檢查（以小鼠Akt基因?yàn)槔?，如下），提交引物設(shè)計(jì)清單。

如何檢查引物設(shè)計(jì)結(jié)果？

點(diǎn)擊引物設(shè)計(jì)列表查看結(jié)果即可看到Akt基因設(shè)計(jì)的引物。 在合成引物之前，我們還需要對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，并利用軟件模擬來觀察它們是否能夠擴(kuò)增我們的目的基因。 。

如何進(jìn)行引物的BLAST驗(yàn)證？

打開網(wǎng)站，下拉，點(diǎn)擊-BLAST，復(fù)制之前設(shè)計(jì)的引物，將選項(xiàng)改為house mouse(taxid:10090)（根據(jù)品系選擇，本例為小鼠品系），最后點(diǎn)擊Get進(jìn)行BLAST驗(yàn)證（結(jié)果需要等待幾秒鐘），觀察結(jié)果，如果驗(yàn)證得到的基因是Akt，即設(shè)計(jì)的引物符合要求，可以用于PCR實(shí)驗(yàn)。

以上是使用兩個(gè)網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物的步驟。 是不是很簡單呢？ 希望對(duì)剛接觸實(shí)驗(yàn)室的朋友有所幫助！

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