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自20世紀90年代探針誕生以來，雖然熒光探針（引物）的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但作為經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，探針技術(shù)仍然是許多實驗研究者進行定量檢測的首選。 這主要是因為與SYBR熒光染料相比，探針具有序列特異性，僅與互補區(qū)域結(jié)合，且熒光信號與擴增的拷貝數(shù)一一對應(yīng)，因此特異性強、靈敏度高，且易于優(yōu)化條件； 而相對于雜交探針來說，只設(shè)計一根探針，因此探針設(shè)計更便宜、更方便，也能完成基本的定量PCR要求。 當然，定量方法仍然需要探針的合成，這也給實驗操作帶來了挑戰(zhàn)。

一般定量PCR實驗流程為：目的基因搜索與比對→探針和引物設(shè)計→探針和引物合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實驗、優(yōu)化條件→獲取曲線數(shù)據(jù)、比對標準曲線→重復(fù)驗證。

第一步：在目標基因搜索和比對過程的第一步dnastar引物設(shè)計，可以使用NCBI序列等軟件完成目標DNA或RNA的搜索和比對——相信很多人在分析測序報告時都這樣做過，而這一步需要注意的重要一點是要確保所分析的序列在內(nèi)（即染色體某些區(qū)域中相鄰DNA片段的重疊）。

第二步：如果其他條件一致，那么這第二步——引物和探針的設(shè)計可以說是定量PCR成功的關(guān)鍵。 通過總結(jié)各方面經(jīng)驗，有以下基本原則：

一般原則

* 先選擇探針，然后設(shè)計引物，使其盡可能靠近探針。

* 所選序列應(yīng)具有高度特異性，并盡量選擇二級結(jié)構(gòu)最少的擴增片段——這是因為二級結(jié)構(gòu)會影響反應(yīng)效率，也會阻礙酶的擴增。 建議先進行二級結(jié)構(gòu)檢測。 如果二次組織無法避免，則應(yīng)相應(yīng)提高退火溫度。

* 擴增長度不應(yīng)超過400bp，最好在100-150bp內(nèi)。 擴增片段越短，越容易獲得有效的擴增反應(yīng)。 較短的擴增片段也更容易確保分析的一致性。

* 保持GC含量在20%到80%之間。 GC豐富的區(qū)域容易發(fā)生非特異性反應(yīng)，這會導(dǎo)致熒光染料分析中的擴增效率降低和非特異性信號。

* 為保證效率和重現(xiàn)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）

* 引物和探針相互配對，以避免形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

引物設(shè)計原則

* 序列選擇應(yīng)在基因的保守片段中

* 避免引物本身或與引物之間形成4個或更多連續(xù)對，避免引物本身形成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)

*典型引物長度為 18 至 24 個核苷酸。 引物需要足夠長dnastar引物設(shè)計，以確保序列的唯一性并減少序列出現(xiàn)在非目標序列位點的可能性。 但引物長度超過 24 個核苷酸并不意味著特異性更高。 較長的序列可能會與錯配的序列雜交，從而降低特異性，并且比短序列雜交得更慢，從而降低產(chǎn)量。

* Tm值為55-65℃（因為核酸外切酶活性在60℃時最高），GC含量為40%-60%

* 避免引物間TM差異超過2℃

* 避免在引物3'端使用堿基A，并避免在引物3'端有3個或更多連續(xù)的相同堿基。

* 為了避免擴增，最好設(shè)計跨越兩個外顯子的引物。

* 探針技術(shù)要求片段長度在 50bp 至 150bp 之間

* 引物末端（最后 5 個核苷酸）不能有超過 2 個 G 和 C。

探頭設(shè)計原理

* 將探針盡可能靠近上游引物

* 探針長度應(yīng)為15-45bp（最好20-30bp）以確保結(jié)合特異性

* 檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu)

* Tm值為65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少5℃），GC含量為40%-70%

* 避免在探針的 5' 端使用 G 鳥嘌呤 - 因為 5'G 會淬滅，即使被切割仍然會發(fā)生淬滅。

* 整個探針中，堿基C的含量應(yīng)明顯高于G的含量——高G含量會降低反應(yīng)效率。 在這種情況下，應(yīng)選擇另一條配對鏈作為探針。

* 為保證引物探針的特異性，最好對設(shè)計的序列進行blast驗證。 如果存在非特異性互補區(qū)域，建議重新設(shè)計引物探針。

MGB探頭設(shè)計

* 避免探針 5' 端出現(xiàn) G。 即使探針被水解成單個堿基，與報告基團連接的G堿基仍然可以猝滅該基團的熒光信號。

*Tm值應(yīng)為65-67℃。

* 盡量縮短MGB探針，但探針長度不應(yīng)小于13bp。

* 盡量避免重復(fù)堿基，尤其是G堿基。 應(yīng)避免 4 個或更多 G 重復(fù)。

* 原則上，只要MGB探針有1個堿基突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針不會與目標片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號）。 因此，在進行SNP檢測時，為了檢測突變體，即MGB不與目標片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目標片段產(chǎn)生熒光信號進行檢測，探針的突變位點應(yīng)盡量放置在探頭的中間1/3處。 地方。

注意：

為了滿足上面要求的四個條件，可以將探針的突變位點移至3'端，但突變位點距離3'端至少2個堿基（即探針的最后兩個堿基）必須確保探針絕對保守）以進行 SNP 測試。 另一方面，如果你想進行類似的檢測，你應(yīng)該尋找保守的片段區(qū)域，并且探針中不應(yīng)該有突變位點。 如果探針只有13 bp，則探針仍然不是完全保守的。 有多個突變，突變位點也應(yīng)該靠近探針的5'端。 這樣，即使存在突變，探針仍然可以與目標片段雜交并產(chǎn)生熒光信號。 另一種方法是設(shè)計簡并探針，即使發(fā)生突變也能檢測到突變。

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