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自20世紀(jì)90年代探針誕生以來(lái)，盡管熒光探針（質(zhì)粒）新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，而作為經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，探針技術(shù)始終是眾多實(shí)驗(yàn)研究者進(jìn)行定量測(cè)量的首選。 主要原因是與SYBR熒光色素相比，探針具有序列特異性，僅與互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合dnastar引物設(shè)計(jì)，但熒光信號(hào)與擴(kuò)增的拷貝數(shù)一一對(duì)應(yīng)，因此特異性強(qiáng)，靈敏度高高，但條件優(yōu)化容易； 與雜交探針相比，該探針只需設(shè)計(jì)一根探針，因此探針設(shè)計(jì)更加經(jīng)濟(jì)、方便，也可以完成基本的定量PCR要求。 事實(shí)上，定量技術(shù)也給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)了挑戰(zhàn)，因?yàn)樘结樔匀恍枰铣伞?/p>

通常，定量PCR實(shí)驗(yàn)的流程為：目的基因搜索與比對(duì)→探針與質(zhì)粒設(shè)計(jì)→探針與質(zhì)粒合成→配置反應(yīng)體系→反應(yīng)參數(shù)→重復(fù)實(shí)驗(yàn)、優(yōu)化條件→獲取曲線數(shù)據(jù)、比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線→重復(fù)驗(yàn)證。

第一步：目標(biāo)基因搜索和比對(duì)流程的第一步，可以利用NCBI序列等軟件完成目標(biāo)DNA或RNA的搜索和比對(duì)——這相信很多人在分析基因時(shí)都會(huì)這樣做測(cè)序報(bào)告。 第一步要注意的是確保分析的序列在a（，即染色體某些區(qū)域中相鄰DNA片段的重疊）內(nèi)。

第二步：如果其他條件相同，那么這第二步——引物和探針的設(shè)計(jì)可以說(shuō)是定量PCR成敗的關(guān)鍵。 通過(guò)總結(jié)各方面經(jīng)驗(yàn)，有以下基本原則：

一般原則

*先選擇探針，然后設(shè)計(jì)盡可能靠近探針的質(zhì)粒。

*所選序列應(yīng)具有高度特異性，盡量選擇二級(jí)結(jié)構(gòu)最小的擴(kuò)增片段——這是因?yàn)槎?jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響反應(yīng)效率，并會(huì)阻礙酶的擴(kuò)增。 建議先檢查二級(jí)結(jié)構(gòu)。 如果二次結(jié)構(gòu)無(wú)法阻止，則應(yīng)相應(yīng)提高固溶溫度。

*擴(kuò)增厚度不要超過(guò)400bp，最好在100-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，越容易獲得有效的擴(kuò)增反應(yīng)。 較短的擴(kuò)增子也往往能確保一致的分析。

*GC濃度保持在20%~80%之間，含有GC的區(qū)域容易發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致熒光顏料分析中擴(kuò)增效率下降，出現(xiàn)非特異性信號(hào)。

*為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)防止重復(fù)的堿基序列，特別是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G）

*質(zhì)粒和探針相互配對(duì)檢查以防止二??聚體和發(fā)夾。

質(zhì)粒設(shè)計(jì)原理

*序列選擇應(yīng)在基因的保守片段中

*防止質(zhì)粒本身或與質(zhì)粒之間連續(xù)4次或以上配對(duì)，并防止質(zhì)粒本身產(chǎn)生環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)

*典型的質(zhì)粒長(zhǎng)度為 18 至 24 個(gè)核苷酸。 質(zhì)粒需要足夠長(zhǎng)以維持序列奇點(diǎn)并增加序列存在于非感興趣序列位點(diǎn)的可能性。 而厚度小于24個(gè)核苷酸的質(zhì)粒并不意味著特異性更高。 較長(zhǎng)的序列可能與錯(cuò)配的序列雜交，從而增加特異性，但雜交速度比短序列慢，從而增加產(chǎn)量。

*55-65°C 時(shí)的 Tm 值（由于 60°C 時(shí)核酸外切酶活性最高），GC 濃度為 40%-60%

*質(zhì)粒之間的TM差異可防止溫度超過(guò)2°C

*質(zhì)粒的3'端阻止使用核苷酸A，質(zhì)粒的3'端阻止3個(gè)或更多連續(xù)的相同核苷酸

*為了防止擴(kuò)增，質(zhì)粒設(shè)計(jì)最好跨越兩個(gè)外顯子。

*探針技術(shù)要求片段寬度為50bp-150bp

*質(zhì)粒末端（最后5個(gè)堿基）不能有超過(guò)2個(gè)G和C。

探頭設(shè)計(jì)原理

*探針的位置盡可能靠近上游質(zhì)粒

*探針寬度應(yīng)為15-45bp（最好是20-30bp）以確保結(jié)合特異性

* 檢查探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu)

*Tm值為65-70℃，一般比質(zhì)粒TM值高5-10℃（至少5℃），GC濃度為40%-70%

*探針的5'端應(yīng)防止使用G - 因?yàn)?'G會(huì)有猝滅作用，但即使被裂解也會(huì)有猝滅作用。

*整個(gè)探針中，核苷酸C的濃度應(yīng)明顯低于G的濃度——高濃度的G會(huì)提高反應(yīng)效率，此時(shí)應(yīng)選擇另一條配對(duì)鏈作為探針。

*為了保證質(zhì)粒探針的特異性，最好在blast中檢查一次設(shè)計(jì)的序列。 如果發(fā)現(xiàn)非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)質(zhì)粒探針。

MGB 探頭設(shè)計(jì)

*探針的 5' 端可防止 G 出現(xiàn)。 盡管探針被酯化為單個(gè)核苷酸，但附著在報(bào)告官能團(tuán)上的G核苷酸仍然可以猝滅該官能團(tuán)的熒光信號(hào)。

*Tm值應(yīng)為65-67°C。

*MGB探針應(yīng)盡可能短，但探針的厚度不應(yīng)超過(guò)13bp。

*盡量避免重復(fù)的核苷酸，特別是G核苷酸，防止4個(gè)或更多的G重復(fù)。

*原則上，只要MGB探針中存在核苷酸突變，MGB探針就會(huì)檢測(cè)到（MGB探針不會(huì)與目標(biāo)片段雜交，不會(huì)形成熒光信號(hào)）。 因此，在進(jìn)行SNP檢查時(shí)，為了測(cè)量突變體dnastar引物設(shè)計(jì)，即MGB不與目標(biāo)片段雜交，不形成熒光信號(hào)，而探針的目標(biāo)片段形成熒光信號(hào)測(cè)量，探頭盡量放置在中間1/3的地方。

注意：

為了滿足上述要求的四個(gè)條件，探針的突變位點(diǎn)可以連接到3'端，但突變位點(diǎn)在3'端前面至少2個(gè)核苷酸（即必須是確保探針核苷酸的最后兩個(gè)核絕對(duì)保守）用于SNP檢查。 反之，如果要進(jìn)行類似的檢查，則應(yīng)找到保守的片段區(qū)域，并且探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。 如果探針只有13 bp，則探針仍然不完全保守。 突變有好幾個(gè)，突變位點(diǎn)也應(yīng)該靠近探針的5'端，這樣即使是突變，探針也能與目標(biāo)片段雜交，形成熒光信號(hào)。 另一種方法是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并探針，即使是突變也能實(shí)現(xiàn)突變的檢測(cè)。

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