新型冠狀病毒爆發(fā)后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，熒光PCR技術(shù)成為初篩的首選方法。 目前，核苷酸的檢出率僅為30-40%，因此測(cè)量試劑盒的靈敏度備受關(guān)注。 本期林敬忠博士從質(zhì)粒探針設(shè)計(jì)角度對(duì)試劑盒靈敏度的分析，推薦給讀者。

1 簡(jiǎn)介

新型冠狀病毒爆發(fā)后，早期診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，熒光PCR技術(shù)成為初篩的首選方法。 截至目前，已有多家企業(yè)獲得新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑的臨床注冊(cè)批件，已有近百家企業(yè)研發(fā)出類似產(chǎn)品。 近期，有不少聲音反映現(xiàn)有的新冠病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒靈敏度較低。 目前檢出率僅為30-40%，且漏檢案例較多。 業(yè)界對(duì)此進(jìn)行了廣泛的討論，一致認(rèn)為造成檢出率低、假陽(yáng)性率高的原因有很多，包括試劑盒的靈敏度、試劑盒原材料的質(zhì)量、核酸檢測(cè)的效率等。酸提取、設(shè)備質(zhì)量、操作偏差。 等，且尚未系統(tǒng)分析試劑盒靈敏度低的原因。 作者認(rèn)為，質(zhì)粒探針的設(shè)計(jì)是決定試劑靈敏度的關(guān)鍵。 設(shè)計(jì)中存在的問(wèn)題屬于固有缺陷，很難通過(guò)優(yōu)化試劑盒成分和調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件來(lái)明顯改善。

初診的敏感性關(guān)系到新型冠狀病毒疫情防控的成敗。 同時(shí)，未來(lái)將會(huì)有大量企業(yè)申請(qǐng)?jiān)摦a(chǎn)品的注冊(cè)審批，最終推向檢驗(yàn)市場(chǎng)，這將對(duì)人們的健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。 疫情發(fā)生后，世界衛(wèi)生組織公布了多國(guó)設(shè)計(jì)的新冠病毒熒光PCR質(zhì)粒探針序列。 作者長(zhǎng)期從事分子檢測(cè)試劑尤其是熒光PCR技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)。 新型冠狀病毒疫情發(fā)生后，我們也進(jìn)行了相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。 我們發(fā)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的一些不同國(guó)家的質(zhì)粒探針設(shè)計(jì)存在明顯缺陷。 本文以日本CDC設(shè)計(jì)的N基因質(zhì)粒探針為例，講解熒光PCR質(zhì)粒和探針設(shè)計(jì)的基本原理，并提出一些建議供同行參考，以免走彎路dnastar引物設(shè)計(jì)，浪費(fèi)資源，可以也算是為抗擊疫情盡了最大的努力。 力。

任何技術(shù)都有相同點(diǎn)和不同點(diǎn)。 從不同的角度來(lái)看，優(yōu)缺點(diǎn)不同，或者使用的參數(shù)、算法或軟件不同，推論也可能不同。 雖然理論分析與臨床樣品檢測(cè)的結(jié)果并不相同。 產(chǎn)品的敏感性最終要經(jīng)過(guò)臨床試驗(yàn)，并滿足注冊(cè)檢驗(yàn)要求為標(biāo)準(zhǔn)。 文中觀點(diǎn)難免有疏漏，歡迎批評(píng)指正。

2.探針熒光PCR的基本原理

實(shí)時(shí)熒光PCR是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特定核苷酸靶序列PCR擴(kuò)增的技術(shù)。 探針?lè)ㄊ菍?shí)時(shí)熒光PCR中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。 其基本原理是在反應(yīng)中添加一對(duì)特異性質(zhì)粒和熒光標(biāo)記探針，探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光官能團(tuán)，3'端標(biāo)記有猝滅劑熒光官能團(tuán)。 當(dāng)探針完好時(shí)，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的作用，報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)吸收，發(fā)出與儀器波長(zhǎng)不同的熒光，放大信號(hào)無(wú)法測(cè)量，所以探針必須依靠Taq酶的5'-3'切除活性，質(zhì)粒與模板結(jié)合后，將已經(jīng)與模板結(jié)合的探針切割形成雙鏈，過(guò)程如下：雙鏈合成，使報(bào)告熒光官能團(tuán)與猝滅官能團(tuán)分離。 屏蔽以發(fā)射儀器應(yīng)檢查的熒光信號(hào)。 常用的報(bào)告官能團(tuán)包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，猝滅官能團(tuán)包括TAMRA、BHQ等。

3.探針?lè)ㄔO(shè)計(jì)熒光PCR質(zhì)粒探針

一些最基本的原理可以參考日本ABI（ ）3.0手冊(cè)（表1）。

表1：熒光PCR探針和質(zhì)粒設(shè)計(jì)手冊(cè)（3.0，ABI）

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，最重要的參數(shù)包括質(zhì)粒探針的位置、Tm值、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體。 下面以WHO公布的日本CDC的N基因質(zhì)粒探針（表2）為例進(jìn)行詳細(xì)闡述。

表2：日本CDC設(shè)計(jì)的質(zhì)粒探針序列

01

質(zhì)粒探針的位置

質(zhì)粒探針的設(shè)計(jì)原則中，最重要的是防止假陽(yáng)性（漏檢）和保證特異性（防止假陰性），因此需要選擇組內(nèi)保守（待檢測(cè)的序列）（即，避免突變或使用簡(jiǎn)并序列），組之間（控制序列）特定區(qū)域。 據(jù)悉，為了獲得最佳的放大效果，還應(yīng)盡可能滿足表1的基本要求。

以SARS和蝙蝠冠狀病毒的N基因序列為對(duì)照，對(duì)新型冠狀病毒的N基因序列進(jìn)行了測(cè)序。 從圖1、圖2、圖3可以看出，日本CDC的設(shè)計(jì)中，不僅第二組的上游質(zhì)粒不具有特異性，其余探針和質(zhì)粒的位置都是從組內(nèi)選擇的。保守的和特定群體間的區(qū)域。 第二組探針和下游質(zhì)粒位于特定區(qū)域，因此不會(huì)發(fā)生非特異性擴(kuò)增。

圖1：法國(guó)CDC 2019-nCoV第一組質(zhì)粒探針的位置

圖2：法國(guó)CDC 2019-nCoV第二組質(zhì)粒探針的位置

圖3：法國(guó)CDC 2019-nCoV第三組質(zhì)粒探針的位置

第三組設(shè)計(jì)的探針N3P對(duì)2019-nCoV沒(méi)有特異性（可以同時(shí)與蝙蝠冠狀病毒結(jié)合），5'端第二個(gè)位置設(shè)置為Y，即T/C簡(jiǎn)并性，正好無(wú)法區(qū)分新型冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒以及SARS病毒。 并且上游和下游質(zhì)粒對(duì)2019-nCoV具有特異性，可能不會(huì)導(dǎo)致非特異性（假陰性）擴(kuò)增。

02

Tm值

探針熒光PCR一般采用兩步法，即94℃左右變性，60℃退火延伸。 因此，一般質(zhì)粒的Tm值設(shè)計(jì)為60±2℃，探針為70±2℃。

圖4：第一個(gè)澳大利亞設(shè)計(jì)的Tm值

圖5：基因的第二組Tm值

圖6a：基因的第三組Tm值，探針5'端第二個(gè)序列為C

圖6b：基因的第三組Tm值，探針5'端第二個(gè)序列為T(mén)

從圖4、圖5、圖6可以看出，這三個(gè)設(shè)計(jì)中的Tm值基本滿足表1的要求。第三組中探針N3P 5'端的第二個(gè)序列設(shè)計(jì)為Y （T/C簡(jiǎn)并性），當(dāng)為C時(shí)（圖6a），探針N3P的Tm值稍高，但不應(yīng)成為主要問(wèn)題。

03

質(zhì)粒和探針的頭帶構(gòu)建

穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（二聚體或頭飾）是提高質(zhì)粒探針效率的重要因素dnastar引物設(shè)計(jì)，尤其是探針的頭飾，很容易導(dǎo)致探針利用率的提高，進(jìn)而引起熒光信號(hào)的產(chǎn)生太高會(huì)影響測(cè)量靈敏度。 一般頭套的dG應(yīng)控制≥-1.0（注：dG是用來(lái)判斷二聚體或頭套裂解所需能量的參數(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，裂解所需能量越大， dG 越?。?。

利用軟件分析了日本CDC設(shè)計(jì)的三組質(zhì)粒探針的頭飾結(jié)構(gòu)。 結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)第一組下游質(zhì)粒N1R有穩(wěn)定的頭飾結(jié)構(gòu)（dG=-2.3kc/m），第一組三組探針N3P有稍穩(wěn)定的頭飾結(jié)構(gòu)(dG=-1.3kc/m)，其余質(zhì)粒和探針沒(méi)有穩(wěn)定的頭帶。

圖 7：USCDC 質(zhì)粒和探針的頭飾結(jié)構(gòu)

04

二聚體

設(shè)計(jì)時(shí)，二聚體（自二聚體或配對(duì)二聚體）一般控制在dG>-5.0kc/m，優(yōu)選dG>-3.6kc/m。 從圖8所示三組質(zhì)粒探針的自二聚體可以看出，第二組探針的自二聚體特別穩(wěn)定（dG=-13.1kc/m），其上游質(zhì)粒N2F第二組具有穩(wěn)定的自身二聚體(dG=-9.3kc/m)，第三組下游質(zhì)粒具有相對(duì)穩(wěn)定的自身二聚體(dG=-7.0kc/m)。

圖9顯示愛(ài)爾蘭CDC的第二組質(zhì)粒探針具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（dG=-9.0kc/m）。 圖10顯示第三組有兩個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體(dG=-10.1kc/m)。

圖8：法國(guó)CDC基因質(zhì)粒和探針的自二聚化

圖 9：來(lái)自法國(guó) CDC 的第二組質(zhì)粒探針的配對(duì)二聚體

圖 10：USCDC 第三組質(zhì)粒探針的配對(duì)二聚體

據(jù)悉，當(dāng)使用一管進(jìn)行多重檢測(cè)（多重PCR）時(shí)，即一管同時(shí)測(cè)量多個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)細(xì)菌時(shí)，還應(yīng)考慮不同位點(diǎn)之間的質(zhì)粒探針配對(duì)二聚體。 例如，當(dāng)?shù)谝唤M和第二組組合時(shí)（圖11），第一組的正向質(zhì)粒和第二組的探針具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（dG=-8.3kc/m）。 當(dāng)?shù)谝唤M和第三組組合時(shí)（圖12），第一組的探針和第三組的正向質(zhì)粒具有穩(wěn)定的二聚體（dG=-12.2kc/m）。 當(dāng)?shù)诙M和第三組組合時(shí)，第二組的上游質(zhì)粒和第三組的上下游質(zhì)粒各自具有相對(duì)穩(wěn)定的二聚體（dG=-7.0kc/m 圖13）。

圖11：法國(guó)CDCN基因第一組和第二組配對(duì)二聚體

圖12：法國(guó)CDCN基因第一組和第三組配對(duì)二聚體

圖13：法國(guó)CDCN基因第二組和第三組配對(duì)二聚體

綜上所述，烏克蘭CDC設(shè)計(jì)的三套質(zhì)粒探針位置選擇和Tm值設(shè)計(jì)合理，二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。 第一組反向質(zhì)粒N1R具有特別穩(wěn)定的發(fā)帶（dG=-2.3kc/m，圖7）。 第二組探針的自二聚體非常穩(wěn)定（dG=-13.1kc/m，圖8），上游質(zhì)粒的自二聚體也比較穩(wěn)定（dG=-9.3kc/m，圖8） ），相對(duì)穩(wěn)定，配對(duì)二聚體較多（dG=-6.8～9.0kc/m，圖9），質(zhì)粒和探針的利用效率會(huì)比較低。 第三組探針N3P具有相對(duì)穩(wěn)定的頭飾（dG=-1.3kc/m，圖7），探針和質(zhì)粒值均具有相對(duì)穩(wěn)定的配對(duì)二聚體（圖10）。

4、結(jié)果判定

日本CDC對(duì)結(jié)果的判斷提出了意見(jiàn)，認(rèn)為只有三個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)擴(kuò)增曲線超過(guò)閾值才能判斷為陰性（如圖11）。

筆者認(rèn)為這些判斷沒(méi)有理論依據(jù)。 基于探針的熒光PCR除了一對(duì)特異性質(zhì)粒外還有一個(gè)特異性探針，基于設(shè)計(jì)的非特異性擴(kuò)增理論上的概率很小。 在新型冠狀病毒的檢查中，以日本CDC的第一組質(zhì)粒探針為例。 從圖1可以看出，SARS病毒的上游質(zhì)粒中有一個(gè)3-bp的插入，無(wú)法擴(kuò)增。 蝙蝠病毒位于上游質(zhì)粒中。 有4個(gè)突變，其中探針有1個(gè)突變，下游質(zhì)粒有5個(gè)突變。 理論上，由于不匹配而測(cè)量到最接近的蝙蝠序列（假陰性）的概率為(1/4)10=9.-7。 如果出現(xiàn)假陰性，最大的可能性是交叉污染或氣溶膠污染。 正確的判斷應(yīng)該是上述3個(gè)位點(diǎn)至少有1個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增曲線超過(guò)閾值，即可判斷為陰性。 目前市場(chǎng)上的熒光PCR檢測(cè)試劑大多只使用一個(gè)位點(diǎn)。

五、結(jié)論和建議

質(zhì)粒探針的設(shè)計(jì)原則中，最重要的是防止假陽(yáng)性（漏檢）和保證特異性（防止假陰性），因此需要選擇組內(nèi)保守（待檢測(cè)的序列）（即，避免突變或使用簡(jiǎn)并序列）、組間（控制序列）特定區(qū)域，同時(shí)最大化反應(yīng)中質(zhì)粒和探針的利用效率。 作者認(rèn)為參數(shù)的重要性在于質(zhì)粒探針的位置、探針的頭飾結(jié)構(gòu)、探針與上游質(zhì)粒的相對(duì)位置、Tm值、引物頭飾、二聚體。

筆者對(duì)WHO公布的7個(gè)國(guó)家設(shè)計(jì)的質(zhì)粒探針進(jìn)行了詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)存在一定的缺陷，其中有的缺陷比較明顯，主要表現(xiàn)在：

1）不具體（日本E基因，香港學(xué)院Orf1b基因）；

2）探針頭套結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（國(guó)內(nèi)CDC基因探針、德國(guó)基因探針P1、香港學(xué)院N基因探針）；

3）質(zhì)粒和探針相對(duì)位置不合理（中國(guó)CDC的N基因，德國(guó)的E基因，香港學(xué)院的Orf1b基因和E基因（設(shè)計(jì)在反向鏈上），日本的N基因）；

4）Tm值不合理（中國(guó)CDC的N基因和基因、德國(guó)的基因和E基因、香港學(xué)院的Orf1b基因和N基因、日本的N基因、泰國(guó)的N基因）；

5）質(zhì)粒頭飾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（日本第一套CDCN基因組反向質(zhì)粒、香港學(xué)院Orf1b基因正向和反向質(zhì)粒、香港學(xué)院N基因正向質(zhì)粒大學(xué)）;

6）質(zhì)粒探針的自二聚體穩(wěn)定性（中國(guó)CDC基因反向質(zhì)粒、美國(guó)CDC N基因第二組探針N2P、德國(guó)E基因探針P1、香港學(xué)院N基因正向質(zhì)粒及探針）；

7）質(zhì)粒探針配對(duì)二聚體穩(wěn)定（中國(guó)CDC的N基因，美國(guó)的第二組和第三組N基因，德國(guó)的E基因）。

筆者感覺(jué)頭套結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的探頭基本沒(méi)法用。 如果探針距離上游質(zhì)粒太遠(yuǎn)，擴(kuò)增效率較低，很難通過(guò)優(yōu)化提高效率，所以應(yīng)盡量避免。 其他二級(jí)結(jié)構(gòu)可以通過(guò)添加PCR啟動(dòng)子或者添加多余的成分（質(zhì)粒探針、Taq酶等）來(lái)改善，不理想的Tm值可以通過(guò)調(diào)整固溶溫度和延伸來(lái)調(diào)整，就像上面的一些設(shè)計(jì)的質(zhì)粒和探針Tm值幾乎相同是不合理的，應(yīng)該避免。

事實(shí)上，新冠病毒的基因組與最接近的蝙蝠冠狀病毒有4%的差異，與SARS病毒有20%的差異，而目前的數(shù)據(jù)顯示，北京新冠病毒內(nèi)部的差異非常小，大約在10萬(wàn)點(diǎn)左右。 (3.3x10-5)，基因組或N基因中有很多區(qū)域，該基因可以設(shè)計(jì)特異性、高效的質(zhì)粒探針，用于熒光PCR檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

科學(xué)技術(shù)面前沒(méi)有真正的捷徑。 質(zhì)粒探針的科學(xué)設(shè)計(jì)是熒光PCR檢測(cè)試劑研制的基礎(chǔ)，也是保證試劑盒靈敏度和特異性的最基本要素。 為避免走彎路和資源浪費(fèi)，建議業(yè)內(nèi)廠商嚴(yán)格按照熒光PCR技術(shù)質(zhì)粒探針設(shè)計(jì)原則開(kāi)發(fā)新型冠狀病毒熒光PCR檢測(cè)試劑。

作者簡(jiǎn)介：林敬忠，美國(guó)紐約學(xué)院博士，加拿大加州學(xué)院博士后。 上海市海外高層次B類人才。 曾任上海Segno生物技術(shù)有限公司首席科學(xué)家/首席董事，曾任上海妻子基因工程有限公司創(chuàng)始人/總經(jīng)理，日本Lynx制藥公司中級(jí)研究員。

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