分子診斷是IVD中增長(zhǎng)最快的子行業(yè)，與美國(guó)的技術(shù)差異最小。 分子診斷技術(shù)有多種類型，目前最成熟、應(yīng)用最廣泛的一種是PCR。 下面簡(jiǎn)單介紹一下PCR中最常用的突變阻斷擴(kuò)增系統(tǒng)。

ARMS的英文名稱是突變阻斷擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS），也稱為等位基因特異性PCR（-PCR、AS-PCR）。 基本原理是，當(dāng)質(zhì)粒的3'端核苷酸與模板完全互補(bǔ)時(shí)，質(zhì)粒才能正常延伸。 如果質(zhì)粒的3'端核苷酸與模板核苷酸不互補(bǔ)，則存在錯(cuò)配，質(zhì)粒延伸受到抑制甚至完全終止。

在基因檢測(cè)中，ARMS原理可用于擴(kuò)增目標(biāo)序列dnastar引物設(shè)計(jì)，同時(shí)防止非目標(biāo)片段的擴(kuò)增。 這些非目標(biāo)片段的擴(kuò)增在PCR中一般稱為非特異性。 非特異性很容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，對(duì)基因檢測(cè)結(jié)果的分析產(chǎn)生不利影響。

為了抑制這些非特異性，一般將ARMS質(zhì)粒3'端最后一個(gè)核苷酸設(shè)置為與突變核苷酸互補(bǔ)，并且最后一個(gè)質(zhì)粒與野生型模板之間存在錯(cuò)配。核苷酸，由于錯(cuò)配，在野生型模板存在的情況下，擴(kuò)增效率很低甚至不進(jìn)行擴(kuò)增。 在實(shí)際工作中，由于質(zhì)粒與野生型模板之間只有一處核苷酸錯(cuò)配，因此大多數(shù)情況下野生型模板也能被擴(kuò)增，即出現(xiàn)非特異性。

為了提高質(zhì)粒的特異性，可以在3'端底部第二個(gè)或第三個(gè)核苷酸處引入額外的錯(cuò)配核苷酸，使質(zhì)粒能夠正常擴(kuò)增目的序列，但非目的片段會(huì)被擴(kuò)增。不被放大。 3'端核苷酸錯(cuò)配根據(jù)其硬度可分為強(qiáng)錯(cuò)配（G/A、C/T、T/T）、中度錯(cuò)配（A/A、G/G、C/C）和弱錯(cuò)配。 與（C/A，G/T）。 如果3'端是“強(qiáng)錯(cuò)配”，則需要引入“弱錯(cuò)配”； 如果3'端是“弱不匹配”，則需要引入“強(qiáng)不匹配”。

2. 提高ARMS質(zhì)粒特異性的途徑

然而，除了單個(gè)質(zhì)粒3'端的錯(cuò)配之外，引入額外的錯(cuò)配并不能完全抑制非特異性擴(kuò)增。 尤其是體外診斷試劑的研發(fā)，對(duì)特異性要求較高，需要采用其他方法來(lái)提高特異性。

1. 提高PCR程序的固溶溫度。 通常，固溶溫度與特異性之間存在如下關(guān)系：固溶溫度越高，特異性越好； 固溶溫度越低，特異性越差。 通過(guò)梯度PCR設(shè)定3～5個(gè)不同的固溶溫度，選擇最合適的PCR固溶溫度。

2. 添加PCR增強(qiáng)劑。 一些PCR增強(qiáng)劑，例如硫酸四乙銨，可以提高質(zhì)粒和模板的特異性。 通常PCR反應(yīng)液中的最終含量為10~50mM。 不同質(zhì)粒最適合的劑量不同，具體應(yīng)用需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。 優(yōu)化。

3.PCR技術(shù)。 通過(guò)在PCR系統(tǒng)中添加序列來(lái)抑制野生型基因的擴(kuò)增，從而提高PCR的特異性。 它是人工合成的單鏈核酸序列。 與質(zhì)粒最大的區(qū)別在于其3'OH被3'-C3、3'-、3'-ddC、3'-End修飾。 由于其3'OH被封閉，不能參與PCR的延伸反應(yīng)。 在PCR固溶階段，序列與野生型模板完全互補(bǔ)，這阻止了PCR質(zhì)粒進(jìn)一步與野生型模板結(jié)合。 然而，序列和突變模板之間存在核苷酸不匹配。 在PCR過(guò)程中，將優(yōu)先考慮PCR質(zhì)粒。 與突變模板互補(bǔ)配對(duì)。

值得一提的是，PNA鉗（PNA）也是目前廣泛應(yīng)用的PCR技術(shù)。 PNA 是一種合成聚合物。 與DNA與DNA之間的鍵合相比，PNA與DNA之間的鍵合更加可靠。 PNA可以特異性地與野生型模板結(jié)合，使得野生型模板不能作為擴(kuò)增的模板。 然而，由于突變模板中存在核苷酸錯(cuò)配，PNA不能與其結(jié)合，因此突變模板可以用于PCR擴(kuò)增。

在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)過(guò)程中，如果對(duì)產(chǎn)品特異性要求非常嚴(yán)格，特別是在開發(fā)一些癌癥靶點(diǎn)抗生素突變基因檢測(cè)產(chǎn)品時(shí)，質(zhì)粒特異性一般不能直接滿足產(chǎn)品設(shè)計(jì)要求。 在具體的應(yīng)用過(guò)程中dnastar引物設(shè)計(jì)，需要結(jié)合以上幾種方式來(lái)提高系統(tǒng)的專用性。 事實(shí)上，對(duì)于不同的模板序列和不同的突變類型，具體方法的應(yīng)用效果是有很大差異的。 因此，具體功效仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

三、總結(jié)

事實(shí)上，ARMS PCR 具有很高的靈敏度，可以測(cè)量低至 1% 的突變； 成本低，PCR系統(tǒng)中的質(zhì)粒探針可商業(yè)化定制。 對(duì)于工業(yè)客戶來(lái)說(shuō)，合成成本更低； 操作簡(jiǎn)單，時(shí)間快，通常2小時(shí)內(nèi)即可得出測(cè)試結(jié)果。 事實(shí)上，也有其固有的缺點(diǎn)。 其測(cè)量通量較低，僅適合測(cè)量單個(gè)基因或少數(shù)基因突變位點(diǎn)。 它只能檢測(cè)已知的突變，不能測(cè)量未知的突變。 即便如此，我們也不得不承認(rèn)，是目前分子診斷產(chǎn)品中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，沒(méi)有之一。

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