您好，博鰲經(jīng)典草藥計(jì)量技術(shù)知識(shí)分享系列明天開始，明天給大家分享第一部分理論部分：

實(shí)驗(yàn)方法原理

PCR技術(shù)的基本原理與DNA的自然復(fù)制過程類似，其特異性取決于與目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸質(zhì)粒。

PCR由三個(gè)基本反應(yīng)步驟組成：變性-固溶-延伸：

①模板DNA的變性：將模板DNA加熱至94℃左右一定時(shí)間后，模板的雙鏈DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA解離，成為單鏈，便于與質(zhì)粒結(jié)合。 回合反應(yīng)計(jì)劃；

②模板DNA與質(zhì)粒固溶（復(fù)性）：模板DNA加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，質(zhì)粒與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)；

③引物延伸：DNA模板-質(zhì)粒結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，以目的序列為模板，根據(jù)核苷酸配對(duì)和半保守原理合成新的互補(bǔ)模板DNA鏈復(fù)制 半保守復(fù)制鏈。

通過重復(fù)循環(huán)變性-溶液-延伸三個(gè)過程，可以獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，但這些新的鏈可以成為上一個(gè)循環(huán)的模板。 完成一個(gè)循環(huán)需要2到4分鐘，要擴(kuò)增數(shù)百萬倍的基因需要2到3小時(shí)。

實(shí)驗(yàn)材料

1. 試劑和試劑盒

2、儀器及耗材

模板DNA

PCR儀

脫氧核糖核酸

移液槍

聚合酶

PCR板

蒸餾水

薄壁管

PCR緩沖液

離心管

質(zhì)粒

離心管盒

溴化鎂

實(shí)驗(yàn)流程

1. 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系

10X 放大緩沖液

10ul

4 dNTP 混合物

個(gè)/升

質(zhì)粒

每次10～

模板DNA

0.1～2ug

聚合酶

2.5u

鎂2+

1.5毫摩爾/升

加入雙蒸水或三蒸水

100ul

2. PCR 質(zhì)粒設(shè)計(jì)

PCR反應(yīng)中有兩個(gè)質(zhì)粒，5'末端質(zhì)粒和3'引物。 設(shè)計(jì)質(zhì)粒時(shí)，以DNA單鏈為基準(zhǔn)（通常基于信息鏈），5'端質(zhì)粒與位于待擴(kuò)增片段5'端的一小段DNA序列相同; 3' 端的一小段 DNA 序列是互補(bǔ)的。

1. 質(zhì)粒設(shè)計(jì)的基本原理

(1)質(zhì)粒寬度：15-30bp，通常在20bp左右。

(2)質(zhì)粒核苷酸：G+C濃度優(yōu)選為40-60％。 如果G+C太少，擴(kuò)增效果不好，如果G+C太多，則容易出現(xiàn)非特異性條帶。 ATGC 最好隨機(jī)分布dnastar引物設(shè)計(jì)，以防止超過 5 個(gè)甾醇或吡啶堿基的簇。

(3) 質(zhì)粒內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

(4)兩個(gè)質(zhì)粒之間不應(yīng)有互補(bǔ)序列，特別是要防止3'端互補(bǔ)重疊。

(5) 質(zhì)粒與非特異性擴(kuò)增區(qū)域序列的同源性不應(yīng)超過70%，且質(zhì)粒3'端的8個(gè)連續(xù)核苷酸在待擴(kuò)增區(qū)域之外不應(yīng)有完整的互補(bǔ)序列，否則容易造成非特異性擴(kuò)增。

(6) 質(zhì)粒3'端的核苷酸，特別是最后一個(gè)和倒數(shù)第二個(gè)核苷酸，應(yīng)嚴(yán)格配對(duì)，最好的選擇是G和C。

(7) 質(zhì)粒的5'端可以進(jìn)行修飾。 如添加限制性酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、使用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記、添加其他短序列dnastar引物設(shè)計(jì)，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2. 質(zhì)粒設(shè)計(jì)軟件

.0（手動(dòng)搜索）*，（質(zhì)粒評(píng)估），，，Omiga，，（在線服務(wù)）。

3. 模板準(zhǔn)備

4. PCR反應(yīng)條件的控制

5. PCR循環(huán)參數(shù)

6. PCR 步驟

看到第二步實(shí)驗(yàn)就已經(jīng)很頭疼了，小編已經(jīng)省略了第三、四、五、六步的介紹了。

您只需要了解PCR原理，剩下的就由博鰲經(jīng)典中藥檢查PCR試劑盒來完成。 無需復(fù)雜的試劑配制、引物設(shè)計(jì)等； 只需要區(qū)分套件A和套件B即可。

本知識(shí)分類系列的發(fā)布，就是為了與廣大藥檢朋友交流、交流、進(jìn)步。 歡迎您留言交流。

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