1：質粒設計原理

(1)質粒寬度為17-25 bp，擴增序列寬度為90-150個核苷酸，GC濃度為40-60%。

（2）Tm值在50℃至60℃之間，上游質粒和下游質粒的Tm值相差不能小于5℃。

(3) 質粒序列A、G、C、T整體分布應盡可能均勻，不能有部分或（特別是3'端），以免T/C結構連續(xù)或 A/G。 防止單個核苷酸連續(xù)重復超過 4 次。

(4) 3'端5個核苷酸中G或C不得少于2個。

(5)避免質粒內或兩個質粒之間出現超過3個核苷酸的互補序列，避免兩個質粒之間3'端出現超過2個核苷酸的互補序列。

(6) 探針應盡可能靠近上游質粒，不能重疊。

(7) 質粒設計完成后，使用-BLAST搜索確認質粒的特異性。

2：探頭設計原理

(1) 探針的厚度不應超過30bp。 理想情況下，15bp 可產生最佳特異性。

(2) 確保探針的Tm值比質粒高5-10℃，在固溶過程中探針會優(yōu)先與模板結合。

(3)探針的5'端不能是G。當G核苷酸與FAM熒光報告官能團連接時dnastar引物設計，G還可以猝滅FAM官能團發(fā)出的熒光信號。

(4)探針應盡量避免二聚體或花狀結構。

(5)選擇C小于G的鏈作為探針。 G的濃度小于C會提高反應效率。

(6)防止多個重復核苷酸的出現dnastar引物設計，特別是4個或更多G核苷酸的出現。

三：質粒探針設計工具

小編推薦的軟件有：5、6、.0.1、、、等。

四：熒光官能團和猝滅官能團

當前的探針方法 qPCR 利用熒光共振能量轉移 (FRET) 現象。 探針上有一對可以形成熒光共振能量轉移的官能團。 熒光硬度發(fā)生變化。

五：MGB探針和SNP分型測量

近年來出現的-MGB探針中，在Taq-Man探針的3端添加了可插入DNA小溝的二氫環(huán)化吡啶復合物三肽（DPI3），使得較短的探針具有較短 TM 值較高會降低雜交反應的特異性。

SNP分型測量探針需要具有較大的熱力學差異，以便在發(fā)生核苷酸錯配時進行測量。 常規(guī)探針的寬度較長，單個核苷酸錯配對整體探針Tm的影響較小。 野生型和突變型探針區(qū)分野生型和突變型探針的功效較差，靈敏度較低，容易產生誤判。 原則上，只要有核苷酸突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針不會與目標片段雜交，不會形成熒光信號）。

6：MGB探頭設計原理

(1)探頭的厚度不宜太長，通常MGB探頭的寬度在13-20nt之間。

(2)突變位點的核苷酸應位于探針中間1/3處(將探針分成三段，SNP位于中間)。 如果這個位置不合適，無法設計出好的探針，可以將SNP位置移至3'端，更靠近MGB功能組。 防止突變位點排列在最后三個堿基上。

(3)其余參考普通探頭的設計原理。

7：多探頭設計原則

(1)設計多重系統時，應注意所有目標基因的質粒或探針的Tm值應相似，質粒的Tm值通常為55-60℃。

(2)不同靶基因的探針應選擇不同的熒光標記官能團，但應選擇發(fā)射波長之間穿透力最小的熒光報告官能團，如常用的FAM、VIC、ROX、CY5等。

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