大家好，博鰲經(jīng)典中藥檢測技術知識分享系列今天正式啟動。 今天給大家分享的是理論部分的第一期：

實驗方法原理

PCR技術的基本原理與DNA的自然復制過程類似，其特異性依賴于與目標序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR 由三個基本反應步驟組成：變性-退火-延伸：

①模板DNA變性：將模板DNA加熱至94℃左右一定時間后，模板DNA的雙鏈DNA或PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，變成單鏈以便它能與底漆結合。 準備圓形反應；

②模板DNA和引物退火（復性）：將模板DNA加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右dnastar引物設計，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對；

③引物延伸：DNA模板-引物綴合物以dNTP為反應原料，在Taq酶的作用下以目的序列為模板。 根據(jù)堿基配對和半保守復制的原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。 半保守復制鏈。

通過重復循環(huán)變性-退火-延伸三個過程，可以獲得更多的“半保留復制鏈”，這條新鏈可以成為下一個循環(huán)的模板。 完成每個循環(huán)需要2至4分鐘，待擴增的目的基因可在2至3小時內(nèi)擴增數(shù)百萬倍。

實驗材料

1. 試劑和試劑盒

2、儀器及耗材

模板DNA

PCR機

脫氧核糖核酸

移液槍

聚合酶

PCR板

蒸餾水

薄壁管

PCR緩沖液

離心管

底漆

離心管盒

氯化鎂

實驗步驟

1. 標準PCR反應體系

10×擴增緩沖液

10ul

4 dNTP 混合物

每個/升

底漆

各10～100 pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶

2.5u

鎂2+

1.5毫摩爾/升

添加雙蒸水或三蒸水直至

100ul

2. PCR引物設計

PCR反應中有兩個引物，即5'引物和3'引物。 設計引物時，使用單條 DNA 鏈作為基準（通?；谛畔㈡湥?。 5'端引物與待擴增片段5'端的短DNA序列相同； 3'端引物與待擴增片段5'端的序列相同。 3' 端的短 DNA 序列是互補的。

1. 引物設計的基本原則

(1)引物長度：15-30 bp，常用的是20 bp左右。

(2)底漆基料：G+C含量優(yōu)選為40-60%。 G+C太少，擴增效果差，G+C太多，容易產(chǎn)生非特異條帶。 ATGC 最好隨機分布，以避免超過 5 個嘌呤或嘧啶核苷酸的簇。

(3)引物內(nèi)部不應有互補序列。

(4) 兩條引物之間不能有互補序列，特別是3′端互補重疊。

(5)引物與非特異性擴增區(qū)的序列同源性不應超過70%。 引物3'端的8個連續(xù)堿基在待擴增區(qū)域之外不得有完全互補的序列，否則容易導致非特異性擴增。

(6)引物3'端的堿基，特別是最后一個和倒數(shù)第二個堿基應嚴格配對。 最好的選擇是G和C。

(7)引物的5'端可以被修飾。 如添加限制性酶切位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，以及添加其他短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

2. 引物設計軟件

.0（自動搜索）*、（底漆評估）、NTI Suit、、Omiga、、（在線服務）。

3. 模板的準備

4. PCR反應條件的控制

5. PCR 循環(huán)參數(shù)

6. PCR 步驟

看看第二步實驗你有沒有頭暈dnastar引物設計，小編省略了第三、四、五、六步的介紹。

您只需了解PCR原理，剩下的由博鰲經(jīng)典中藥檢測PCR試劑盒完成。 無需繁瑣的試劑配制、引物設計等； 您只需區(qū)分套件 A 和套件 B 即可。

本知識分類系列的發(fā)布，是為了與廣大中藥檢測同仁交流、溝通、進步。 歡迎大家留言交流。

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